大麦醇溶蛋白是一种典型的疏水型蛋白，具有优良的表面特性、生物可降解性、生物相容性和抗氧化性。根据其分子质量大小与氨基酸组成等方面的差异，可将大麦醇溶蛋白分为B-hordein、C-hordein、A-hordein与D-hordein共4 类。B-hordein分子质量为30～50 kDa，是大麦醇溶蛋白的主要组分，约占总醇溶蛋白的70%；C-hordein的分子质量为50～80 kDa，占总大麦醇溶蛋白的10%～20%，是大麦醇溶蛋白中的第二大组分大麦醇溶蛋白具有较强的成膜性等天然活性。研究发现，基于大麦醇溶蛋白的纳米颗粒在模拟胃消化中能够较好地抵抗胃消化。
复凝聚反应是指当两种带相反电荷的聚电解质在溶液中共存时通过静电吸引而发生相分离产生沉淀的过程。目前，在食品领域研究较多的复凝聚体系为蛋白质/多糖复凝聚体系与多糖/多糖复凝聚体系。其中，对蛋白质/多糖复凝聚体系的研究较多，在该体系下形成的复凝聚物具有良好的胶凝能力与乳化能力，因此，蛋白质/多糖复凝聚体系在食品领域有着广泛的应用。
当蛋白质与多糖发生复凝聚反应时，一部分蛋白质组分优先与带相反电荷的多糖结合，发生相分离并形成复凝聚物，而另一部分蛋白组分因带电性、空间结构等因素而不与多糖结合，离心后，结合蛋白质进入沉淀而未结合保留在上清液中。这种现象被称为选择性复凝聚，通过这一反应可实现不同大分子组分的分离。
本课题组曾研究了大麦醇溶蛋白与ι-卡拉胶（Car）的选择性结合，利用这种选择性结合行为，可获得B-hordein/Car复凝聚物与仅含有C-hordein的上清液，理论上，初步实现了C-hordein与B-hordein的分离。然而，通过调节pH值（碱溶）无法将全部的B-hordein与Car有效分离，这导致B-hordein的回收率过低（＜50%）。考虑到果胶是一种富含半乳糖醛酸的羧基类多糖，分散在水溶液中主要带负电，具备发生复凝聚反应的条件，因此，采用低酯果胶（LMP）与高酯果胶（HMP）作为本研究的主要材料。
山东农业工程学院食品科学与工程学院的李非凡*、迟晓君、秦洋等拟检验大麦醇溶蛋白与两种果胶的选择性结合情况，分析蛋白质的组分分离效果，通过制备蛋白组分与CS的复合物，表征不同蛋白组分在构建黏膜吸附递送系统中的作用效果。本研究通过检验选择性结合行为在组分分离中的可行性，以期为开发规模化分离蛋白组分的新方法提供技术支持，同时为构建基于生物大分子的黏膜吸附型递送载体提供理论参考。
01
大麦醇溶蛋白的提取与鉴定结果
经Osborne法提取的大麦醇溶蛋白的分子质量分布如图1所示，分子质量30～50、55～80 kDa的条带清晰可见，分别对应B-hordein与C-hordein，二者均为大麦醇溶蛋白的主要组分；而＞85、＜15 kDa的条带较浅，分别对应D-hordein与A-hordein，说明二者的含量相对较低，这与Mohamed和Shewry等的报道一致，他们的研究结果均表明B-hordein和C-hordein是大麦醇溶蛋白的主要组分，分别占总蛋白的70%～80%和10%～20%；A、D组分的总和不足总蛋白的5%。上述结果表明，利用Osborne法可有效提取大麦醇溶蛋白。
02
混合体系的Zeta电位
通过表征大麦醇溶蛋白与两种果胶在pH 11.0～3.0范围内的Zeta电位，判断是否可能发生复凝聚反应。如图2所示，滴定前蛋白带负电，随着pH值的降低，电位绝对值逐渐降低，当pH值达6.6时，蛋白的电位值接近0，表明大麦醇溶蛋白的pI≈6.6，这与已有报道相符。进一步降低pH值，蛋白带正电，电位随pH值的降低而增大。以上结果表明，在pH 11.0～3.0范围内，随着pH值的降低，大麦醇溶蛋白可实现由负电位向正电位的转变，在此基础上，蛋白与果胶可通过静电引力相互结合。
HMP与LMP均为羧酸类多糖，如图2、3所示，当分散液的pH值由11.0降低至3.0时，HMP的电位值由-12.2 mV增大至-0.7 mV，LMP的电位值由-14.3 mV增大至-2.4 mV。与HMP相比，LMP的电位绝对值较大，这可能是由于LMP的酯化度较低，羧基基团的占比较高，从而导致其电位绝对值较高。除此之外，pH值为11.0时，Hordein/HMP与Hordein/LMP混合体系均带负电，对于Hordein/HMP混合体系（图2），当蛋白/果胶比例为1∶1～10∶1时，混合体系在pH 6.0～7.0左右实现电中和（Zeta电位由负电位开始转变为正电位），这证明了复凝聚反应的发生。此外，在Hordein/LMP混合体系中（图3）也观察到了类似结果。上述结果说明，Hordein/HMP与Hordein/LMP混合体系均可发生复凝聚反应。
03
混合体系的浊度
通过浊度滴定实验记录复凝聚反应过程中pHc、pHφ、pHmax与最大浊度值，研究大麦醇溶蛋白与HMP、LMP的复凝聚行为。如图4所示，对于大麦醇溶蛋白，当pH值由11.0逐渐降低至7.4时，其浊度值基本保持不变；当pH值由7.4继续降低时，蛋白浊度迅速增大，并在pH 6.6时达最大值，这是由于体系pH值接近蛋白等电点，进而导致了蛋白的絮凝。继续降低pH值，浊度迅速降低，直至与初始浊度值相同。
在pH 11.0～3.0范围内，HMP（图4）与LMP（图5）的浊度值未发生明显变化。对于Hordein/HMP、Hordein/LMP复合物，在pH 11.0～3.0范围内，可观察到复合物的pHc、pHφ、pHmax。其中，pHc表示可溶性复合物的形成，对于Hordein/HMP混合体系，其pHc由10.0（Hordein/HMP10∶1）逐渐降低至7.2（Hordein/HMP1∶1），在Hordein/LMP混合体系中也可以观察到类似结果。数值上，复合物的pHc均大于单一蛋白的pI，这可能是由于在特定pH值下，大麦醇溶蛋白表面存在局部正电荷补丁，促进了蛋白与阴离子多糖的结合。同时，除静电引力外，还存在氢键作用等其他非共价作用，共同促进了复合物的形成。
pHφ表示不溶性复合物的形成，当pH值降低至pHφ时，体系的浊度值快速升高，这是由于复合物表面电荷降低，静电斥力进一步减小。pHmax为浊度值最大时的pH值，pHmax表示复合物中带有正、负电荷的聚合物实现了电中和，复合物表面电荷为零，此时静电斥力最小，发生相分离，导致浊度进一步增大。本实验中，随着蛋白比例的减少，Hordein/HMP与Hordein/LMP混合体系的pHmax逐渐降低，这是由于蛋白比例的减少使混合体系中带正电基团的比例减小，因此，需要在蛋白正电位绝对值较高，即混合体系pH值较低时，才能实现电中和，这与已有报道相符。
当pH值降低至pHmax时，Hordein/HMP与Hordein/LMP混合体系均出现最大浊度值。值得一提的是，大麦醇溶蛋白达pI时的浊度值约0.54，远大于蛋白/果胶混合体系的最大浊度值0.24（Hordein/HMP10∶1，pH 7.4），并且，蛋白/果胶体系的最大浊度值随果胶比例的增大而减小，这可能是由于增大果胶的比例进一步改善了大麦醇溶蛋白的分散性。达pHmax后，继续降低pH值使蛋白/果胶体系的浊度值持续降低，直至与初始值相同，这可能是由于羧基类多糖与蛋白的结合能力较弱，pH值的降低使二者之间的静电斥力增大，导致了二者的分离。由此推测，调节pH值可以使果胶与其结合的蛋白组分良好地分离。
04
选择性结合情况分析
通过SDS-PAGE分析大麦醇溶蛋白主要组分与HMP、LMP的选择性结合，评估通过复凝聚反应分离蛋白组分的可行性。如图6所示，大麦醇溶蛋白（泳道H）的条带清晰可见，其中，分子质量分布在30～50、55～80 kDa的条带分别为B-hordein与C-hordein。复凝聚物的电泳结果表明，在质量比1∶1～10∶1时，Hordein/LMP与Hordein/HMP的复凝聚物中均仅含有B-hordein而不含C-hordein，说明B-hordein具有优先与LMP、HMP结合的特性，相比之下，C-hordein不会优先与LMP、HMP结合。
观察上清液的电泳结果发现，在质量比10∶1时，上清液中均明显含有C-hordein与B-hordein，随着果胶比例的增大，Hordein/LMP中B-hordein条带的颜色逐渐变浅，即上清液中B-hordein的含量逐渐降低，这是因为越来越多的B-hordein与LMP结合并形成复凝聚物，然而，在Hordein/HMP中无法观察到这一趋势。这一现象说明，LMP与B-hordein的结合能力强于HMP，这可能是因为LMP的电位绝对值相对较大，因而具有更强的结合能力。
然而，即使在Hordein/LMP1:1的上清液中，仍能观察到微量的B-hordein（红色虚线部分），说明仍有少量B-hordein未能与LMP结合，即少量B-hordein未能被有效地分离。实验中，若继续增大LMP、HMP的比例，蛋白/果胶复合物将变得可分散，无法形成复凝聚物。所以，通过HMP无法实现B-hordein与C-hordein的分离，通过LMP可分离大部分的B-hordein。
基于上述实验结果，收集Hordein/LMP1:1体系下的复凝聚物与上清液，并根据1.3.6节所述方法进行蛋白质组分的分离。结果显示，上清液中蛋白样品的回收率为（32.66±3.08）%；复凝聚物中的蛋白组分可以与LMP有效分离，蛋白样品的回收率为（65.29±1.74）%，基于电泳结果进行推测，这些蛋白样品均为B-hordein。此外，通过苯酚-硫酸法检测发现，上清液、复凝聚物中蛋白组分获得的果胶残留率均小于4.0 μg/g，说明分离得到的蛋白样品中不含有LMP。
05
蛋白质谱分析
取图6部分Hordein/LMP1:1中复凝聚物与上清液对应的电泳凝胶，将电泳条带完整切下，用于质谱实验。根据肽段序列进行匹配并计算emPAI，并按照丰度的大小排序。如表1所示，复凝聚物中共鉴定出27 种多肽，其中大多数为B-hordein的部分片段，同时，比较了29 个肽段的emPAI值，结果显示，鉴定为B-hordein的多肽具有较高丰度，尤其是prf||1103203A的emPAI值可达27 930。相比之下，虽然也鉴定出C、D和γ-hordein的部分片段，但这些蛋白组分的emPAI值较低，均小于200。以上结果说明，B-hordein占所获取复凝聚物的绝大多数。
如表2所示，上清液中鉴定出30 条多肽，这些多肽分别来自B、C、D-hordein和γ-hordein。与其他组分相比，被鉴定为C-hordein的多肽具有较高的丰度。其中，AAA32943.1的emPAI值为10 702，远高于其他多肽。这说明，C-hordein占所获取上清液的绝大多数。此外，同时检测到了序列号为prf||1103203A的B-hordein，这与电泳结果相符。上述质谱实验结果表明，在Hordein/LMP1:1混合体系中，大部分B-hordein优先与LMP结合，借助这一选择性结合机制，虽然无法将B、C-hordein组分完全分离，但可以从复凝聚物中获得以B-hordein为主的蛋白组分，即该蛋白组分中B-hordein的纯度较高。基于此，将复凝聚物、上清液中分离得到的蛋白组分记作“B-hordein”与“C-hordein”，通过后续实验比较不同蛋白组分的黏附效果。
06
黏度与模量
通过检测复合物（Hordein/CS、B-hordein/CS、C-hordein/CS）、黏蛋白以及二者混合物的黏度值，选取剪切速率r为2、10 s-1时的黏度值进行分析，评价不同蛋白组分的黏附效果。如表3所示，3 种复合物的ηenhancement均大于0且ηrelative均大于1，说明其在生理条件下均具有良好的黏附效果。这可能是由于CS是阳离子多糖，当其覆盖在蛋白表面时，复合物与黏蛋白之间存在一定的静电引力，且CS含有的羟基、氨基等极性基团，使复合物具有吸水溶胀的特性，进一步增强了复合物的黏附效果。当r＝2 s-1时，B-hordein/CS的ηenhancement为（238.9±14.3）mPa·s，ηrelative为3.78±0.10，显著高于Hordein/CS与C-hordein/CS复合物（P＜0.05）；当r＝10 s-1时B-hordein/CS表现出相同的趋势，说明B-hordein/CS复合物与黏蛋白结合后的黏附效果更强。这可能是由复合物的粒径、分散性等多种因素的改变而共同导致的。
进一步通过拉伸实验比较复合物的黏附能力。如表4所示，B-hordein/CS的最大分离力为13.8 mN，与Hordein/CS的数值（13.2 mN）接近，显著高于C-hordein/CS（12.3 mN）（P＜0.05）；B-hordein/CS的总黏附功为29.8 μJ，显著高于C-hordein/CS（25.9 μJ）（P＜0.05）。B-hordein与Hordein的结果接近，这可能是因为B-hordein是Hordein的主要组分；B-hordein的黏附效果优于C-hordein，可能是由于B-hordein/CS复合物的粒径更小，因为纳米颗粒的粒径对其黏膜吸附与细胞摄取具有重要影响。Luo Yangchao等使用CS纳米颗粒负载并递送亚硒酸钠，结果发现，减小CS纳米颗粒的粒径可以有效增强其黏附效果，同时提高黏膜对亚硒酸钠的吸收效率。这一结果进一步说明B-hordein/CS复合物与黏蛋白结合后的黏附效果更强。由此推测，基于B-hordein/CS复合物的递送载体具有更强的肠道黏附能力，这有利于增大其递送效果。
结论
本研究通过表征大麦醇溶蛋白与LMP和HMP的选择性复凝聚反应，优化了B-hordein的分离方法，评估了不同蛋白组分的黏附性能。结果表明，B-hordein作为大麦醇溶蛋白的主要组分，优先与LMP和HMP结合形成复凝聚物，其中LMP因其较低的酯化度和较高的电荷密度，表现出更强的结合能力。通过Hordein/LMP1:1体系的复凝聚物，成功分离出纯度较高的B-hordein，回收率可达65.29%，且果胶残留率低于4.0 μg/g。HPLC-Q-Exactive-MS/MS进一步证实了复凝聚物中B-hordein的蛋白质丰度显著高于其他组分。主要反应均在分散液中进行，无需高精度的检测仪器，因此该工艺具有工厂化、规模化的开发潜力。此外，黏附性能研究结果表明，B-hordein与CS形成的复合物（B-hordein/CS）表现出最佳的黏附效果。流变学测试显示，B-hordein/CS的ηenhancement与ηrelative显著高于其他复合物（P＜0.05）。拉伸实验也表明，B-hordein/CS的最大分离力和总黏附功均优于C-hordein/CS，验证了其在构建黏膜吸附型递送系统中的潜在价值。综上所述，本研究验证了选择性结合现象在分离蛋白组分中的应用潜力，提出了一种高效、低成本的B-hordein分离技术，为深入探究其理化性质及在功能食品和药物递送领域的应用提供了理论依据。后续研究可进一步优化分离工艺，提高回收率，进而探索B-hordein在复杂食品体系或生物医学材料中的实际应用潜力。
作者简介
通信作者：
李非凡，山东农业工程学院食品科学与工程学院讲师，工学博士，毕业于中国农业大学。现任山东农业工程学院讲师，主要研究方向为农产品加工与蛋白质/多糖复凝聚反应；发表多篇学术论文，其中以第一作者身份发表SCI论文5 篇；参与申请2 项发明专利；曾参与国家转基因生物新品种培育科技重大专项与国家重点研发计划专项。
本文《B-大麦醇溶蛋白的分离优化与黏附效果》来源于《食品科学》2025年46卷第19期79-88页，作者：李非凡，迟晓君，秦 洋，卜令金，时宇航。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250421-167。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：南伊；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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