中国浓香型白酒发酵是在传统泥窖中由混合菌群进行的固态分批发酵。浓香型白酒发酵体系是一个典型的己酸合成代谢体系。窖泥是己酸生成菌（以下简称“己酸菌”）等厌氧菌的持续释放源，在每个批次的发酵后期与酒醅发酵沉积形成的黄水混合形成“窖泥-黄水微发酵体系”进行代谢。发酵结束后，溶解于乙醇-水混合物中各种微生物的代谢产物与乙醇一起经过蒸馏形成浓香型白酒的风味成分。目前的研究表明，与“窖泥-黄水微发酵体系”共存的窖池底部酒醅蒸馏得到的白酒品质最好。其中的己酸和己酸乙酯含量相对较高。增加己酸降低乳酸，通过酸醇酯化增加己酸乙酯的含量并同时降低乳酸乙酯的含量，即“增己降乳”有利于提高浓香型白酒的发酵品质。
安徽工程大学生物与食品工程学院的王秀本、张会敏*和安徽文王酿酒股份有限公司的常强等为探究窖泥与黄水空间异质性情况下连续分批发酵窖泥对黄水己酸菌群及其己酸合成代谢的影响，模拟浓香型白酒发酵后期窖泥-黄水微发酵体系分别设计接种窖泥的“窖泥-黄水微发酵体系”（受窖泥影响大）和无接种窖泥的“黄水微发酵体系”（受窖泥影响小）并进行连续4 轮发酵，分别分析两者连续分批发酵后原核菌群结构、代谢产物和理化参数的变化规律，以期为解析窖泥在浓香型白酒实际生产过程中的己酸合成代谢规律和己酸菌合成代谢提供理论基础。
1 新鲜窖泥与黄水样本的理化参数
如表1所示，HS组中富含己酸菌群生长所需要的碳源（葡萄糖、乳酸、乙醇）、氮源（铵态氮）以及磷元素（有效磷）等，这与前人研究结果基本一致。与HS组相比，PM组中可以作为碳源的葡萄糖、乳酸、乙醇以及己酸合成（中间）代谢产物乙酸、丁酸、己酸等成分含量较低，推测可能与窖泥菌群固态发酵过程较慢的热交换和代谢反应率有关。此外，与HS组相比，PM组的pH值相对更偏中性，铵态氮与有效磷含量更丰富，推测可能因为固态窖泥阻挡强酸性黄水渗透，此外窖泥中存在降解乳酸和蛋白的菌群，如可降解乳酸的
Caproiciproducens和可降解蛋白的
Aminobacterium，有助于提高pH值，同时提高铵态氮和有效磷的含量。
2 “窖泥-黄水微发酵体系”连续厌氧培养后原核菌群结构组成及其
多样性通过对“窖泥-黄水微发酵体系”连续培养的PSF1～PSF4样本进行16S rRNA V4区扩增子高通量测序，共获得736 005 条优质序列，抽平后60 339 条序列/样本。4 个连续培养菌群样本的测序覆盖率均大于99.99%，表明测序结果可以反映其原核菌群结构。4 个样本中的ASV数目依次增加（109.00±4.24～147.00±1.41），表明“窖泥-黄水微发酵体系”连续培养过程中，菌液中的原核菌群种类在逐渐增加。在门水平上，厚壁菌门（
Firmicutes）占绝对优势，PSF1～PSF4组（（99.61±0.55）%）平均的
Firmicutes相对丰度比HS组（（81.90±3.33）%）更高（图2A）。在属水平上，与HS组相比，PSF1～PSF4组中的优势原核菌属由HS组的Lactobacillus（（62.84±1.38）%）转变为潜在己酸菌属
Caproiciproducens
Clostridium_sensu_stricto_12、
Clostridium_sensu_stricto
Haloimpatiens
Ligibactobacillus（图2B）。其中
Caproiciproducens的相对丰度含量最高，且随着连续培养次数增加逐渐上升（（45.90±0.30）%～（57.18±1.27）%）。
Clostridium_sensu_stricto_12与丁酸的生成具有较强相关性，为潜在的丁酸生成菌（以下简称丁酸菌），其在培养液中相对丰度趋于稳定（（7.64±2.37）%），两者均存在于浓香型白酒窖泥和黄水发酵体系中。此外，归属于
Lactobacillus
Ligibactobacillus
Haloimpatiens均存在于窖泥中。黄水中的绝对优势菌属
Lactobacillus更适宜在偏酸性条件下生长代谢；经过“窖泥-黄水微发酵体系”连续富集，更适宜在偏中性条 件生长代谢的
Caproiciproducens得到更多富集，与Zhu Xiaoyu等的研究结果基本一致，同时与Wang Huilin等使用葡萄糖或葡萄糖与乙醇两者作为碳源连续富集得到菌液的组成规律类似。此外，菌液在“窖泥-黄水微发酵体系”连续富集过 程中，反映菌液菌群丰富度的Chao1指数呈逐渐上升趋势（图2C），而菌群多样性Simpson指数无显著变化（图2D），表明菌液在连续培养过程中菌群物种种类基本稳定，其丰度逐渐提高，与图2B结果相印证。结果表明“窖泥-黄水微发酵体系”为以潜在己酸菌
Caproiciproducens为主的菌群生长提供了适宜的生长条件。
3 “黄水微发酵体系”连续厌氧培养后原核菌群结构组成及其
多样性通过对“黄水微发酵体系”连续培养的HSF1～HSF4样本进行16S rRNA V4区扩增子高通量测序，共获得472 044 条优质序列，抽平后45 505 条序列/样本。4 个连续培养菌群样本的测序覆盖率均大于99.99%，表明测序结果可以反映其原核菌群结构。4 个样本中的ASV数目依次减少（29.00±2.83～14.50±0.71），表明“黄水微发酵体系”连续培养过程中菌液的原核菌群种类在逐渐减少。在门水平上，
Firmicutes占绝对优势，HSF1～HSF4组（（99.93±0.06）%）平均的
Firmicutes相对丰度比HS组（（81.90±3.33）%）更高（图3A）。在属水平上，潜在丁酸菌
Clostridium_sensu_stricto_12占绝对优势，由HSF1中的（78.87±10.72）%，上升为HSF2～HSF4中的（96.17±2.90）%（图3B），表明潜在丁酸菌
Clostridium_sensu_stricto_12在“黄水微发酵体系”中经连续培养后占绝对优势。同时，菌液菌群的Chao1指数逐渐下降（图3C），Simpson指数基本无显著变化（图3D），表明菌液连续培养过程中的菌群物种种类基本稳定，其丰度逐渐提高，与图3B的结果相印证，推测“黄水微发酵体系”为
Clostridium_sensu_stricto_12的生长提供了适宜的生长条件。
4 原核菌群结构的PCA
使用基于ASV列表相对丰度的PCA评估各样本原核菌群结构的相似性，结果如图4所示。基于特征值的2 个PC方差贡献率分别为77.16%和20.46%，累计方差贡献率接近于100%，表明PCA结果非常接近于各样本原核菌群结构之间的差异或者相似性。经过“窖泥-黄水微发酵体系”和“黄水微发酵体系”连续培养的菌液原核菌群分别聚类在一起，均与连续培养之前的黄水原核菌群结构差异较大，随着连续发酵次数的增加，相似度越来越高，表明2 种发酵体系的连续培养有利于原核菌群结构的逐渐稳定，富集培养出适应各自培养条件的特征性菌群结构。
5 连续培养菌液原核菌群结构的理化参数变化规律
如图5所示，“窖泥-黄水微发酵体系”和“黄水微发酵体系”富集的菌液均可降解培养基中的乳酸、乙醇和葡萄糖3 种碳源，其中降解乳酸和葡萄糖的比例相对较高，降解乙醇的比例相对较低。与“窖泥-黄水微发酵体系”相比，“黄水微发酵体系”富集的菌液降解乳酸和乙醇的水平较高，且随着富集次数的增加而逐渐增加（图5A、B）。“窖泥-黄水微发酵体系”富集菌液降解葡萄糖的水平较高，“黄水微发酵体系”富集菌液降解葡萄糖的水平偏低且呈逐渐增加趋势，在第4次富集培养时与“窖泥-黄水微发酵体系”的降解葡萄糖水平接近（图5C）。结果表明2 种发酵体系富集的菌群对碳源的降解偏好性稍有不同。“窖泥-黄水微发酵体系”对3 种碳源的降解顺序依次为葡萄糖、乳酸和乙醇；“黄水微发酵体系”对3 种碳源的降解顺序依次为乳酸、葡萄糖和乙醇。2 种发酵体系均对乙醇具有较低的降解水平，有利于保证实际浓香型白酒发酵过程中的白酒产量。两者较大的差异表现在对葡萄糖和乳酸的偏好性上。
由图6A可知，随着连续培养次数的增加，“黄水微发酵体系”菌液代谢导致pH值增加幅度更大。推测可能与“黄水微发酵体系”中菌液的乳酸降解能力更强有关，乳酸的降解有利于pH值的增加。由图6B～D可知，“窖泥-黄水微发酵体系”富集的菌群主要在葡萄糖存在的条件下降解葡萄糖生成少量的丁酸和较多的己酸，而且随着富集次数的增加，己酸产量逐渐增加（0.22～2.75 g/L），接近于Wang Huilin等通过以葡萄糖为碳源的mCGM合成培养基2 次连续富集菌群的己酸生成水平；“黄水微发酵体系”富集的菌群主要降解乳酸生成较多丁酸和少量的己酸，其降解乙酸（（0.59±0.03）～（0.96±0.02）g/L）和生成丁酸（（1.34±0.06）～（2.25±0.05）g/L）的水平均随着富集次数的增加而增加，其丁酸生成水平接近于Tao Yong等分离的丁酸菌株
Clostridiumsp. BPY5在纯培养条件下的丁酸生成水平。两种体系在己酸合成代谢中表现出的巨大差异，推测与其中富集的优势菌属代谢功能存在巨大差异有关，“窖泥-黄水微发酵体系”富集的
Caproiciproducens占绝对优势（图2B），其“增己”功能较强；而“黄水微发酵体系”富集的
Clostridium_sensu_stricto_12占绝对优势（图3B），其“增丁”功能较强。丁酸、己酸及两者分别与乙醇酯化形成的丁酸乙酯和己酸乙酯为浓香型白酒特征性风味成分中重要的酸和酯。两者在葡萄糖存在情况下均表现出较强的降解乳酸能力。综上，“窖泥-黄水微发酵体系”连续富集的潜在己酸菌具有较强的“增己降乳”代谢功能，在实际生产过程中，靠近池底窖泥-黄水微发酵体系的酒醅发酵品质更好，而远离窖泥-黄水发酵体系的酒醅中丁酸含量可能会更高。此外，本研究所使用的“窖泥-黄水微发酵体系”和“黄水微发酵体系”连续富集模式能够靶向性富集己酸菌和丁酸菌混合菌群，为靶向性富集浓香型白酒发酵的功能菌群提供参考，其产物中长链脂肪酸及其衍生物可以开发成抗菌剂、饲料添加剂、食品添加剂，在医学治疗、代谢调控、环保等领域具有重要应用价值。
6 连续培养菌液中的优势菌属分析
使用从浓香型白酒发酵体系所分离
Caproicibacterium的16S rRNA V4区序列对潜在己酸菌属
Caproiciproducens中的ASV序列进行NCBI BLASTn二次注释，进一步分析2 种发酵体系连续培养后的菌液中潜在优势菌种。如图7A所示，随着对“窖泥-黄水微发酵体系”进行连续培养，潜在己酸菌属
Caproiciproducens呈逐渐增加趋势（（45.90±0.30）%～（57.18±1.27）%），表明
Caproiciproducens逐渐得到富集。随着
Caproiciproducens的逐渐富集，
Caproicibacterium相对丰度（（26.35±1.73）%～（37.66±0.59）%）逐渐递增，其优势ASV与菌株
C. lactatifermentansLBM19010呈100%相似，其相对丰度基本稳定。同时，在“窖泥-黄水微发酵体系”富集的己酸菌液中，潜在丁酸菌属
Clostridium_sensu_stricto_12的相对丰度呈稳定趋势，其优势ASV与丁酸菌
C. tyrobutyricumATCC 25755呈100%相似，其相对丰度含量稳定且较低。以上结果表明，在“窖泥-黄水微发酵体系”中，己酸菌属占绝对优势，而丁酸菌属的相对丰度很低，同时其中蕴藏着未知己酸菌与丁酸菌资源。推测，己酸菌与丁酸菌在“窖泥-黄水微发酵体系”可能存在潜在协同代谢关系，后续有待进一步研究。上述结果直接证明窖泥是己酸菌的持续释放源，与Wang Xueshan等的研究结果一致。如图7B所示，在“黄水微发酵体系”中潜在丁酸菌属
Clostridium_sensu_stricto_12占绝对优势，其相对丰度（（78.87±0.72）%～（98.38±0.18）%）随着富集培养次数的增加而增加，然后逐渐趋于稳定。其中的优势ASV与“窖泥-黄水微发酵体系”中的
C. tyrobutyricumATCC 25755相同。而在“黄水微发酵体系”中，潜在己酸菌属
Caproiciproducens的相对丰度甚微，其中优势ASV与已知己酸菌
C. argilliputeiZCY20-5呈100%相似。由此推测，在没有窖泥提供持续菌种缓释的情况下，丁酸菌比己酸菌相对更具有生长优势。
7 连续培养菌液中原核菌群结构与理化参数的RDA
由图8A可知，2 个坐标可解释原核菌群结构96.58%的变化，2 个坐标轴的相关性分别高达99.30%和91.10%，表明菌群结构与理化参数变化值之间具有较强的相关性。乙酸（85.50%）、葡萄糖（8.30%）、己酸（4.20%）、丁酸（0.70%）、乳酸（0.50%）、乙醇（0.50%）和pH值（0.20%）等理化参数变化量对菌液原核菌群结构的贡献依次降低。其中，乙酸、葡萄糖、己酸、丁酸变化量具有显著贡献。推测乙酸作为己酸或者丁酸合成的共同底物，其消耗对两组代谢体系菌群的生长具有重大贡献。2 种发酵体系连续培养后菌液原核菌群结构主要在坐标轴1上差异聚类，乙酸、乳酸、丁酸、乙醇和pH值的变化与“黄水微发酵体系”连续培养菌液呈正相关，表明以上参数的变化与其原核菌群结构的定向富集具有较强相关性。己酸和葡萄糖的变化与“窖泥-黄水微发酵体系”连续培养呈正相关，表明底物己酸和葡萄糖的代谢与其原核菌群结构的定向富集具有较强相关性，与2.5节的结论相印证。如图8B所示，菌群结构与碳源和己酸合成相关产物等的RDA结果表明2 个坐标轴可解释原核菌群结构97.28%的变化，并且2 个坐标轴的相关性高达99.82%和86.29%，表明菌液的菌群结构与其发酵后理化参数之间具有较强相关性。培养后菌液的丁酸（96.3%）、葡萄糖（2.00%）、己酸（1.00%）、乳酸（0.20%）、乙酸（0.20%）、乙醇（0.20%）和pH值（0.10%）等理化参数对菌群结构的贡献度依次降低，其中丁酸、葡萄糖和己酸对菌液菌群结构具有显著贡献。推测丁酸作为己酸或者丁酸合成的共同产物，其合成对2 组发酵体系菌群的生长具有最大贡献，其余理化参数对菌群结构的影响有待将来进一步研究。2 种发酵体系连续培养后菌液原核菌群结构主要在坐标轴1上差异聚类，发酵后乙酸、乳酸、乙醇的含量与“窖泥-黄水微发酵体系”连续培养菌液的菌群结构呈正相关，发酵后丁酸和葡萄糖的含量与“黄水微发酵体系”连续培养后菌液原核菌群结构呈正相关。
8 连续培养菌液中原核菌群己酸合成代谢功能预测分析
进一步通过Picrust2工具对2 种发酵体系连续培养后菌液原核菌群分别进行底物代谢和通过RBO、FAB代谢途径进行己酸合成代谢的功能进行预测分析。
如图9A所示，通过“窖泥-黄水微发酵体系”富集的菌群参与乙酸和乙酰辅酶A代谢的乙醛脱氢酶、磷酸转乙酰酶和乙酸激酶水平较高（聚类1）；通过“黄水微发酵体系”富集的菌群参与丙酮酸、乳酸和乙醇底物降解的丙酮酸脱氢酶、乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶水平较高（聚类2）。表明“黄水微发酵体系”富集的菌群降解乳酸和乙醇的能力更强，与2.5节的结果相印证。
如图9B所示，通过“窖泥-黄水微发酵体系”富集的菌群参与电子传递、合成丁酸和己酸代谢的铁氧还蛋白氢化酶、丁酰辅酶A（乙酸辅酶A转移酶、磷酸丁酰转移酶、丁酸激酶和酰基辅酶A硫酯酶）水平均较高（聚类3），表明“窖泥-黄水微发酵体系”富集的菌群具有持续合成中间产物丁酸并进一步合成己酸的能力，其预测较强的己酸合成能力与2.5节实际检测到较高的己酸合成水平相印证。然而，通过“黄水微发酵体系”富集的菌群参与合成乙酸→丁酸和丁酸→己酸中间产物代谢的酮酰基辅酶A还原酶（3-羟酰基辅酶A脱氢酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶）、短链酰基-CoA脱氢酶、乙酰乙酰辅酶A硫解酶和3-羟基丁酰辅酶A脱水酶水平较高（聚类4），推测“黄水微发酵体系”富集的菌群可能缺乏进行己酸合成完整代谢链所需要的酶，进而不利于合成己酸。“窖泥-黄水微发酵体系”连续富集的潜在己酸菌与“黄水微发酵体系”连续富集的潜在丁酸菌均可通过RBO碳链延长反应生成己酸或者丁酸，因此在浓香型白酒发酵体系中丁酸菌与己酸菌之间是否有潜在协同代谢作用有待进一步研究。
如图9C所示，通过“窖泥-黄水微发酵体系”富集的菌群参与合成丁酰基-
-酮酰基-ACP、己酰基--酮酰基-ACP、丁酰基--羟脂酰-ACP、己酰基--羟脂酰-ACP、丁酸和己酸代谢的酰基辅酶A硫酯酶、-酮酰基-酰基载体蛋白合成酶I、-酮酰基-酰基载体蛋白合成酶II、磷酸丁酰转移酶、丁酸激酶、-酮酰基-ACP还原酶和3-羟基脂酰ACP脱水酶水平较高（聚类5）；通过“黄水微发酵体系”富集的菌群参与丁酸和己酸合成过程中的中间产物丁酮酰基-ACP、己酮酰基-ACP、丁酰基--酮酰基-ACP、己酰基--酮酰基-ACP代谢的烯醇基ACP还原酶、丙二酰转移酶、-酮酰基-酰基载体蛋白合成酶III、乙酰辅酶A羧化酶水平较高（聚类6）。由上述结果推测在连续培养的菌液中可能同时存在己酸合成的RBO和FAB代谢通路，这与Zhu Xiaoyu和Zhao Wenyan等对具有己酸合成功能菌群的代谢通路分析结果一致。9 “窖泥-黄水微发酵体系”和“黄水微发酵体系”连续培养菌液中乳酸降解功能菌群分析
基于上述分析可知，“黄水微发酵体系”富集丁酸菌降解乳酸的能力更强，“窖泥-黄水微发酵体系”富集己酸菌合成代谢己酸的能力更强。因此，浓香型白酒发酵体系中起降解乳酸作用的菌主要是丁酸菌。为证明该结论，分别将PSF4与HSF4菌液接种到以乳酸为唯一碳源的选择培养基中培养3 d，分别形成PSS和HSS菌液，其优势原核菌属均为潜在丁酸菌属
Clostridium_sensu_stricto_12（（83.92±8.49）%、（90.09±5.42）%），同时包含一定丰度的
Staphylococcus
Sporolactobacillus（图10A）。与PSS菌液相比，HSS菌液降解乳酸的能力更强，能够生成更多的丁酸。PSS菌液中己酸菌属的相对丰度消失殆尽，而潜在丁酸菌属的相对丰度大幅度增加；PSS菌液仍可大量降解乳酸，而合成己酸的水平虽然比HSS菌液稍多，但与PSF菌液相比，其己酸合成水平显著降低（图6D和图10B）。推测
Caproiciproducens的生长代谢需要葡萄糖，在葡萄糖存在的情况下，
Caproiciproducens可以降解乳酸产生己酸，而乳酸作为唯一碳源则会影响
Caproiciproducens的生长。这与Wang Huilin等研究发现窖泥中优势菌株
C. lactatifermentansLBM19010的代谢特征一致。在实际浓香型白酒发酵过程中，葡萄糖是淀粉糊化、进一步糖化后的主要产物，同时作为后续发酵形成乙醇的主要底物，其在黄水形成的浓香型白酒发酵后期含量很少，而且其作为包括己酸菌在内很多厌氧菌代谢的速效碳源迅速减少。以乳酸作为唯一碳源的丁酸菌对于己酸菌是一种补充，推测两者在“降乳”功能上相互协同，而“增己”功能则主要由己酸菌实现。因此，在实际浓香型白酒发酵过程中为保证己酸菌的己酸合成代谢，需要一定的残糖留存。对PSS和HSS原核菌群结构进行PCA可知，两者的菌群结构聚类相近（图10C），与两者菌群结构分析结果相印证。
结论
本实验通过“窖泥-黄水微发酵体系”和“黄水微发酵体系”进行连续4 轮富集培养，分别研究了有窖泥和无窖泥情况下对黄水原核菌群结构、底物降解和己酸合成相关理化参数以及富集优势功能菌的影响。“窖泥-黄水微发酵体系”富集的菌群中潜在己酸菌属
Caproiciproducens占绝对优势，伴随部分潜在丁酸菌属
Clostridium_sensu_stricto_12，其主要在存在葡萄糖的情况下降解乳酸，并以乙酸为电子受体生成少量的丁酸和较多己酸。即在存在葡萄糖的情况下，“窖泥-黄水微发酵体系”富集的菌群具有“增己降乳”功能。“黄水微发酵体系”富集的菌群中潜在丁酸菌属
Clostridium_sensu_stricto_12占绝对优势，主要降解乳酸生成丁酸和少量的己酸。即在存在葡萄糖的情况下，“黄水微发酵体系”富集的菌群具有“增丁降乳”功能。“窖泥-黄水微发酵体系”中的优势己酸菌株为
C. lactatifermentansLBM19010，“黄水微发酵体系”中的优势丁酸菌株为
C. tyrobutyricumATCC 25755。通过RDA和Picrust2功能预测分析推测底物葡萄糖有利于窖泥中己酸菌在黄水连续富集过程中代谢生成己酸，底物乳酸有利于黄水中丁酸菌在连续富集过程中代谢生成丁酸。进一步通过乳酸选择培养基证实在不存在葡萄糖的情况下己酸菌具有生长优势，丁酸菌在菌群富集过程中起主要乳酸降解作用。结果表明，窖泥对浓香型白酒发酵过程中的己酸合成代谢具有重要作用，能够靶向富集己酸菌和丁酸菌混合菌群。本实验可为将来进一步研究己酸菌和丁酸菌之间的协同代谢提供理论支撑。
本文《 浓香型白酒发酵体系己酸菌液的连续富集及其“增己降乳”功能 》来源于《食品科学》2025年46卷第16期153-164 页， 作者： 王秀本，常 强，甄 莉，崔 磊，薛正莲，王 越，席鲜会，徐康杰，孙 伟，张会敏* 。 DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250104-025 。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑：林安琪；责任编辑：张睿梅。点击下方 阅读原文 即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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