鱼糜制品具有营养丰富、口感细腻等特点，深受全球消费者的喜爱。不同于传统漂洗鱼糜，不漂洗鱼糜中含有较多的水溶性蛋白质（酶）、不饱和脂质以及金属离子、色素等促氧化剂，在冻藏过程中易发生蛋白质、脂质氧化及蛋白质冷冻变性等变化。为确保不漂洗鱼糜的质量和稳定性，添加抗冻剂和抗氧化剂是一种行之有效的方法。
鱼糜加工中常用的抗冻剂主要为糖类、磷酸盐类及其复配物等传统抗冻剂。近年来，越来越多研究开始利用低值鱼类或鱼类加工副产物酶解制备、筛选抗冻或/和抗氧化活性成分，并在改善冷冻鱼糜品质方面显示出较好的效果。鲢鱼为我国典型的高产、低值淡水鱼，目前主要用于加工成冷冻鱼糜，而加工过程中会产生占鱼总质量60%～70%的副产物，若能利用这些副产物为原料制备多功能肽，重新用于鱼糜产品的品质提升，不仅能拓展鲢鱼加工副产物的高值化利用途径，还有望解决制约不漂洗鱼糜工业化生产的瓶颈问题。
长沙理工大学食品与生物工程学院的江祥瑶、戴新佳、王发祥*等利用鲢鱼加工副产物制备抗冻、抗氧化双效肽（下称双效肽），并评估其对不漂洗鲢鱼鱼糜反复冻融过程中品质变化的影响，旨在为应对不漂洗鱼糜贮藏稳定性差的难题提供一种新的生物源性解决方案。
1 双效肽的制备和性质表征
如图1a所示，双效肽冻干粉的水分相对含量为8.52%，蛋白质相对含量为74.59%，灰分相对含量为13.51%，说明本研究制备的双效肽中，除多肽（或蛋白）以外，还含有较多的灰分，其主要来源可能是酶解过程中加入的NaCl以及原料自身的少量无机盐；Tricine-SDS-PAGE分析表明，除了12 kDa左右的条带外，双效肽中组分的分子质量基本小于1.2 kDa（图1b）。一般来说，分子质量小于3 000 Da有利于多肽发挥生物活性。如Wang Shaoyun等的研究表明分子质量在600～2 700 Da的抗冻肽更容易吸附至冰晶表面，从而抑制冰晶长大；邓梅等指出淡水鱼抗氧化肽的自由基清除能力与分子质量有较强的相关性，分子质量越小，清除能力越强；洪燕婷等的研究也表明分子质量500～1 800 Da的多肽抗氧化活性较佳。在本研究中，制备的双效肽经液相色谱-串联质谱分析共鉴定出705 条肽，其中约91%的肽分子质量小于3 000 Da，有373 条肽为预测的抗冻抗氧化双效肽，比较典型的双效肽序列有AVPGPMGPMGPR、DIDHDEYRF等（结果未列出）。
以热滞活性和冻融酵母菌存活率衡量双效肽的抗冻活性，结果如图1c所示。双效肽的热滞活性为0.84 ℃，而同质量浓度的牛血清白蛋白热滞活性仅为0.09 ℃。研究表明，当多肽的热滞活性处于0.6～6.0 ℃时，可被认为是“高活性”抗冻肽。因此，本研究制备的双效肽理论上具有较好的抗冻活性。将双效肽加入酵母菌悬液中，冻融后酵母存活率仍为74.4%，而对照组仅为5.1%，表明双效肽对酵母细胞具有良好抗冻保护活性，能显著提高酵母菌冻融存活率。这与其较好的热滞活性相印证，也与课题组前期研究鲢鱼酶解产物对酵母菌的抗冻保护效果结果基本一致。进一步分析双效肽的抗氧化性质，结果如图1d所示。双效肽的DPPH自由基清除率可达69.0%，ABTS阳离子自由基清除率为48.4%，分别约为相同质量浓度抗坏血酸（VC）的70%和50%。Lin Jun等利用不同蛋白酶水解大头鱼鱼鳃蛋白，发现其水解物的DPPH自由基清除率在较低浓度可达60%～80%；颜阿娜利用酶法制备三文鱼骨抗氧化肽，最优条件下制备的抗氧化肽酶解液的DPPH自由基清除率和ABTS阳离子自由基清除率分别为81.64%和71.04%，分子质量主要分布在180～1 000 Da，与本研究结果基本类似。因此，制备的双效肽同时具有较好的抗冻和抗氧化活性，有望加工成一种多功能鱼糜改良剂，同步解决不漂洗鱼糜贮藏过程中冷冻损伤和氧化劣变的问题。
2 双效肽对不漂洗鱼糜冻融过程中蛋白质变性和氧化的影响
蛋白质如图2a所示，冻融前两组鱼糜样品的蛋白含量（64.06～66.34 mg/g）无显著差异（
P＞0.05），但经过冻融循环处理后，两组样品的肌原纤维蛋白含量均剧烈下降，可能是因为冻融过程中冰晶的形成和重结晶导致肌原纤维蛋白脱水变性，致使其溶解性下降，也可能与冻融过程中鱼糜氧化劣变引起肌原纤维蛋白过度交联聚集有关。双效肽组鱼糜的肌原纤维蛋白含量下降相对较慢，冻融6 次后下降至17.70 mg/g，降幅比空白组（15.08 mg/g）减少5%。这说明添加双效肽能一定程度上阻止不漂洗鱼糜肌原纤维蛋白的变性和聚集，从而减缓鱼糜品质劣变，与张金等的研究结果一致。
Ca2+-ATPase活性通常用作衡量肌球蛋白分子完整性的标志物，其变化水平反映了鱼糜中肌原纤维蛋白的变性程度。如图2b所示，经过冻融处理后，两组鱼糜的Ca2+-ATPase活性均显著下降（
P＜0.05），表明冻融过程中鱼糜肌原纤维蛋白会严重变性，主要原因可能是冰晶的形成对蛋白质结构造成破坏，以及反复冻融过程诱导的蛋白质间相互作用、重排、聚集和氧化 。冻融6 次后，双效肽组的Ca 2+ -ATPase活性由最初的0.27 μg/（min·mg）下降至0.09 μg/（min·mg），保留率（33%）比空白组（0.06 μg/（min·mg），22%）提高11%，表明添加双效肽减轻了鱼糜肌原纤维蛋白的变性程度，从而保护鱼糜蛋白结构完整性和功能性质，延缓鱼糜冻融过程中的品质劣变。Peng Xinyan等 在研究乳清蛋白水解物对鱼糜抗冻保护效果时也观察到了类似的结果。此外，两组鱼糜的Ca 2+ -ATPase活性在前3 次冻融循剧烈下降，其后下降速率有所平缓，可能是因为其冻融早期的变化主要由剧烈的物理破坏和最不稳定蛋白质的快速变性失活主导，而后续冻融循环对残留Ca 2+ -ATPase活性的破坏作用变得缓慢而渐进，主要表现为氧化变性、轻微的物理损伤和持续的品质劣化累积效应 。
如图2c所示，随着冻融循环次数的增加，蛋白质羰基含量显著增加（
P＜0.05），表明冻融过程中鱼糜肌原纤维蛋白发生了氧化反应。冻融过程中，活性氧（如羟自由基）、氧化肽裂解以及脂质氧化产生的氧自由基会诱导某些氨基酸残基转化为羰基，从而造成蛋白质的损伤、聚集和功能特性的丧失 。冻融6 次后，空白组鱼糜的蛋白羰基含量由初始值（2.12 nmol/g）增加至4.30 nmol/g，而双效肽组鱼糜蛋白羰基含量为3.55 nmol/g，增幅仅为对照组增幅的65%，说明添加双效肽对鱼糜蛋白羰基形成有一定的抑制作用，可能与双效肽的抗氧化和抗冻组分有关，其通过稳定蛋白结构、清除活性氧自由基等作用阻止自由基对肌原纤维蛋白侧链的攻击，从而减轻蛋白氧化损伤和变性 ，增强不漂洗鱼糜的冻融稳定性。
3 双效肽对不漂洗鱼糜冻融过程中脂质氧化的影响
TBARS值是衡量脂质二次氧化程度的典型指标，尤其是在高脂肪含量的水产品中。如图2d所示，随着冻融次数的增加，两组鱼糜的TBARS值均逐渐升高，表明发生了一定程度的脂质氧化，这与Li Jiayi等报道的结果一致。与空白组相比，双效肽组鱼糜的TBARS值全程较低；冻融6 次后，双效肽组的TBARS值由冻融前的2.88 mg/kg升至4.04 mg/kg，增幅为40%，比空白组（3.09 mg/kg升至5.09 mg/kg，增幅为65%）低25%。这说明添加双效肽一定程度上抑制了鱼糜中脂质氧化，这主要与双效肽较好的抗氧化活性有关，能通过清除活性氧自由基阻断自由基链式反应，从而减轻脂质氧化。此外，双效肽还具有良好的抗冻活性，能抑制冰晶的形成和长大，从而减少冻融过程中机械损伤引起的肌细胞促氧化因子（如氧化酶、金属离子、色素等）释放，延缓脂质氧化和MDA等脂质过氧化产物的生成。这也与课题组前期研究鲢鱼酶解产物通过双重抗冻和抗氧化作用抑制不漂洗鱼糜中MDA含量升高的结果一致。
4 双效肽对不漂洗鱼糜冻融过程中凝胶形成能力的影响
不漂洗鱼糜冻融处理0、3、6 次循环后再加工成鱼糜凝胶，如图3所示，冻融前两组样品的凝胶强度相当，冻融处理后均逐渐下降，表明其凝胶形成能力降低；在反复冻融过程中，冰晶的多次形成和重结晶会破坏肌细胞结构，促进内源酶和促氧化因子的释放，进而导致蛋白质氧化、变性和肌纤维结构完整性丧失，影响鱼糜的凝胶形成能力。冻融6 次后，双效肽组鱼糜的凝胶强度降低了24%（从691 g·cm降至526 g·cm），降幅是空白组（32%）的75%，说明添加双效肽有利于保护鱼糜肌原纤维蛋白结构和功能的完整性，从而维持不漂洗鱼糜的凝胶形成能力；这得益于双效肽较好的低温保护和抗氧化作用，一定程度上阻止了鱼糜蛋白的冷冻变性和氧化损伤。此外，冻融过程中鱼糜凝胶形成能力的降低与其肌原纤维蛋白的溶解性和Ca2+-ATPase活性的变化趋势一致，与Lin Jun和MacDonald等的研究结果吻合。
5 双效肽对不漂洗鱼糜凝胶冻融损失的影响
鱼糜冻融损失常用来评价其贮藏稳定性，能反向表征鱼糜凝胶的持水能力和结构完整性。如图4所示，随着冻融循环次数的增加，两组鱼糜的冻融损失均显著升高（
P＜0.05）；冻融损失增加可能是因为冻融过程中冰晶的融化和重结晶对鱼糜肌原纤维蛋白和凝胶网络的结构性损伤，降低了蛋白质的水结合能力，也可能与脂肪氧化引起的蛋白质变性和结构变化有关。冻融6 次后，空白组鱼糜的冻融损失为2.0%，而相应双效肽组的冻融损失仅为1.2%，显著低于空白组（
P＜0.05），说明添加双效肽提升了不漂洗鱼糜凝胶的冻融稳定性。这与双效肽的双重抗冻和抗氧化作用密切相关，通过减轻鱼糜凝胶的冻融损伤和抑制肌原纤维蛋白的变性、氧化从而保护鱼糜凝胶品质。
6 双效肽对不漂洗鱼糜凝胶冻融过程中水分迁移的影响
从图5a可以看出，不漂洗鱼糜凝胶冻融过程有0～10（
T21 ）、10～100 ms（
T22 ）和100～1 000 ms（
T23 ）的3 个峰，其中
T21 表示与大分子紧密结合的结合水，
T22 表示包裹在肌原纤维网络中的物理束缚水，
T23 表示位于肌原纤维网格外的 自由水。其中，
T22 的峰面积最大，说明鱼糜凝胶中大部分水分为物理束缚水，这与Zhai Yueying等的研究结果一致。两组鱼糜凝胶的
T2 曲线基本相似，但与空白组相比，双效肽组
T22 的峰位置均略微向更低的弛豫时间移动，表明添加双效肽降低了鱼糜凝胶中水分的自由度。
不同状态水的迁移可通过不同水的峰面积百分比反映，冻融过程中对应的
T21、
T22、
T23 峰面积比例(
P21、
P22、
P23) 变化如图5b所示。随着冻融循环次数增加，两组鱼糜凝胶均呈现
P22 降低，
P23 升高，表明凝胶中部分物理束缚水转变为自由水。这可能与蛋白质功能特性的丧失以及反复冻融引起的凝胶结构破坏有关。然而，与空白样品相比，冻融过程中双效组鱼糜凝胶中
P23 升高和
P22 降低的幅度相对更小，说明较少的物理束缚水转化为自由水；冻融6 次后，双效肽组凝胶的
P22 和
P23 分别为86.82%和8.36%，而空白样品相应为84.61%和10.83%。这些结果表明，不漂洗鱼糜凝胶中添加双效肽有助于限制其水分迁移，从而改善鱼糜凝胶的冻融稳定性。
7 双效肽对冻融过程中冰晶生长的影响
图6a展示了不漂洗鱼糜凝胶冻融过程中冰晶的形状和分布的变化情况，其中不规则的白色区域表示冰晶，而红色区域代表鱼糜凝胶组织。新鲜鱼糜样品仅有些许不易察觉的白点，可能是鱼糜凝胶成型过程中留下的小气孔；3 次冻融循环后，在两组中都观察到许多不规则的白色区域，说明冻融过程中鱼糜凝胶内部形成了许多冰晶，从而对鱼糜凝胶网络结构造成机械损伤，导致凝胶特性下降；6 次冻融循环后，可观察到更多大颗粒的冰晶，可能是由于反复冻融过程诱导冰晶重结晶形成了更大的冰晶，冰晶体的生长进一步破坏了凝胶结构完整性，这与其不断增加的冻融损失相印证。然而，与空白组样品相比，相同冻融次数时双效肽组凝胶中冰晶尺寸明显较小，尤其是在冻融6 次的样品中冰晶大小的差异更加明显。如图6b所示，冻融6 次后，空白组鱼糜凝胶冰晶平均面积为11 252 μm2，较其冻融3 次时的冰晶平均面积（10 197 μm2）增加了10%；而双效肽组鱼糜凝胶冰晶平均面积约为7 974 μm2，虽然也较冻融3 次时（7 575 μm2）增加了5%，但仅为相同冻融循环次数时空白组的71%。这些发现表明，双效肽抑制了较大冰晶的形成，从而减轻鱼糜凝胶结构在反复冻融循环期间的机械损伤。有研究指出抗冻肽可以吸附在冰晶表面通过Kelvin效应抑制冰晶生长，阻止冰晶聚集和重结晶，从而控制冰晶的大小和形状，使形成的冰晶细小均匀。双效肽中含有较多分子质量小于1.2 kDa的抗冻组分，能不可逆地附着于冰晶特定表面有效抑制冰晶生长、修饰冰晶形态和重结晶，从而降低冰晶对鱼糜凝胶造成的机械损伤，这与Liang Jiajian等的研究结果相符。
结论
反复冻融循环会导致不漂洗鱼糜品质劣变，表现为其凝胶形成能力降低、解冻损失增加、TBARS值上升，以及蛋白Ca2+-ATPase活性下降、羰基含量上升。鱼糜加工过程中产生大量副产物，利用其酶解制备双效的抗冻、抗氧化肽，用于改善不漂洗鱼糜的贮藏稳定性，具有营养、健康的特性，同时又兼顾效益和效率等优势。通过中性蛋白酶水解鱼糜加工副产物，成功制备出双效肽，具有较好的热滞活性、酵母菌低温保护活性及DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除活性；将其加入不漂洗鱼糜中能有效抑制冻融过程中冰晶长大及蛋白质冷冻变性，减缓脂质和蛋白质氧化，减少其水分迁移和冷冻损失，从而提高不漂洗鱼糜及其凝胶的冻融稳定性。因此，双效肽可用作一种新型的多功能添加剂，同时解决不漂洗鱼糜冻藏过程中防止氧化和抗冻保护的难题。然而，目前的双效肽是混合肽，具体的肽种类以及单独抗冻肽和抗氧化肽如何协同发挥作用仍需要进一步研究明确。
本文《抗冻/抗氧化双效肽对不漂洗鱼糜冻藏品质的调控》来源于《食品科学》2025年46卷第20期297-305页，作者：江祥瑶，戴新佳，何 斌，尹世鲜，刘永乐，李向红，王发祥。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250428-239。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：杨欣瑞；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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