摘要：生物制药生产中，澄清工艺作为上游收获环节的关键步骤，负责去除细胞培养液中的不溶性固体、细胞碎片等杂质，为下游纯化奠定基础。传统上该工艺被认为对关键质量属性（CQA）贡献有限，但随着细胞密度和产物滴度提升，其重要性日益凸显。本文围绕质量源于设计（QbD）理念，系统阐述澄清工艺的优化策略，包括 QbD 核心概念应用、澄清技术选择、关键工艺参数（CPP）与关键质量属性（CQA）界定、实验设计（DoE）的实践应用等，为生物制药澄清工艺的高效开发与质量控制提供参考。
一、QbD 理念在生物制药中的发展与应用
质量源于设计（QbD）理念始于 20 世纪 70 年代，由约瑟夫・朱兰博士提出，核心是将质量设计融入产品开发与生产全过程，而非依赖最终产品检验。ICH Q8 (R2) 将其定义为 “基于科学和质量风险管理，强调对产品和工艺的理解及控制的系统开发方法”。
2003 年美国 FDA 推行当前良好生产规范（cGMP），2005 年 EMA 和 ICH 相继出台相关指南，推动 QbD 在制药行业的应用。起初 QbD 多用于小分子药物生产，2009 年后逐渐拓展至生物制药领域，尤其在单克隆抗体（mAb）产品中应用广泛。
如图 1 所示，单克隆抗体在生物制药市场中占比达 25%，2009-2021 年获批数量从约 10 个增至 50 个。2022 年 WHO 发布针对 mAb 产品的 QbD 指南，进一步推动其在生物制药中的规范化应用，为患者安全和生产效率提升提供保障。
图1：生物制药市场产品类型占比
二、生物制药澄清工艺概述与技术选择
澄清工艺是生物制药上游生产的核心环节，通过离心、过滤、沉淀或絮凝等技术，去除细胞培养液中的不溶性固体、细胞、碎片等杂质，保留目标产物并部分去除宿主细胞蛋白（HCP）等可溶性杂质，为下游纯化减负。
近年来，一次性深层过滤技术因成本效益高、操作高效等优势备受青睐。随着细胞密度提升，沉淀和絮凝预处理技术逐渐兴起，通过调节 pH、添加絮凝剂等使杂质聚集，再结合深层过滤实现高效分离。
表 1 对比了常用沉淀剂和絮凝剂的作用机制、操作条件及效果。例如，低 pH - 金属沉淀通过电荷中和作用，HCP 去除率可达 1-3 LRV；阳离子絮凝剂借助静电氢键作用，DNA 去除率高达 4-6 LRV，但需关注 scalability 和毒性问题。选择预处理技术时，需综合考虑杂质去除效果、产物稳定性和成本等因素。
表 1：预处理过程中常用沉淀剂和絮凝剂的对比
如图 2 所示，澄清工艺可组合使用离心、深层过滤、微滤等技术，初级澄清去除大颗粒杂质，次级澄清去除胶体和可溶性杂质，部分场景需增加微孔过滤降低下游工艺负担。
图 2：生物制药上游生产中初级和次级澄清步骤选项
三、澄清工艺的质量风险与关键参数界定
澄清工艺是上游生产中变异性较大的单元操作，其质量风险主要来自可提取物和浸出物（E&Ls）、亚硝胺杂质等。如图 3 所示，BPOG 提出的浸出物风险评估模型（表 2），从生产流程距离（DAS）、暴露温度、时间等维度评估风险，澄清工艺因使用深层过滤，风险等级可能从低升至中等。
表 2：BPOG 浸出物风险评估模型示例
关键质量属性（CQA）是确保产品安全有效的核心指标，澄清工艺的 CQA 包括产物收率、HCP、宿主细胞 DNA（HCD）、内毒素、浊度等。关键工艺参数（CPP）则包括离心速度、过滤通量（LMH）、缓冲液 pH、渗透压、进料压力等，这些参数直接影响杂质去除效果和产物稳定性。
图 4 的鱼骨图清晰展示了影响澄清工艺的关键因素，包括细胞系、培养条件、收获规模、杂质类型、过滤材料和工艺参数等。通过风险评估工具如失效模式与影响分析（FMEA），可量化风险优先级（RPN），如表 4 所示，低收率（RPN=40）、HCP 水平（RPN=36）等是需重点关注的风险点。
图 4：澄清工艺鱼骨图分析示例
表 4：澄清工艺相关 CQA 的 FMEA 结果示例
四、QbD 在澄清工艺中的实践路径：从 DoE 到设计空间
QbD 在澄清工艺中的应用遵循 “QTPP-CQA-CPP-DoE - 设计空间” 的路径。首先明确质量目标产品概况（QTPP），界定 CQA；通过风险评估识别 CPP；借助实验设计（DoE）优化参数，建立设计空间，确保工艺在可接受范围内稳定运行。
早期工艺开发阶段，需优化收获条件（如细胞密度、存活率、pH）和筛选过滤材料。如表 7 所示，通过筛选不同初级和次级深层过滤组合，评估产物收率、HCP 去除率等指标，确定最优过滤方案。 Bracewell的研究表明，收获时间延长会导致 HCP 水平显著升高，需通过 DoE 平衡产物收率和纯度。
表 7：过滤材料筛选研究示例
工艺表征阶段，采用响应面法（RSM）等 DoE 技术优化 CPP。表 8 和表 9 以通量和渗透压为关键参数，设置不同水平进行实验，通过方差分析（ANOVA）和预测分析确定设计空间。如图 6 和图 7 所示，利用 JMP 软件的预测分析器和设计空间分析器，可直观呈现参数范围对 CQA 的影响，例如产物收率≥50% 时对应的通量和渗透压范围。
表 8：澄清工艺设计空间 DoE 准备
图 6：澄清工艺预测分析器示例
图 7：澄清工艺设计空间分析器示例
五、澄清工艺的放大与技术转移
工艺放大是从实验室到生产的关键环节，需确保不同规模下 CQA 的一致性。实验室规模（1-10 L）采用小型过滤装置（20-25 cm²），中试规模（10-100 L）选用 0.11-0.55 m² 过滤面积，生产规模（1000 L 以上）则需组合多个过滤装置，过滤面积达 10-30 m²。
表 11 展示了不同细胞密度和存活率下的深层过滤选型方案，例如低细胞密度（≤10⁷ cells/mL）高存活率时，D0SP/X0SP 组合的过滤容量可达 120-250 L/m²。放大过程中需进行间隙分析，采用 FMEA 等工具重新评估风险，确保工艺稳定性和合规性。
表 11：深层过滤材料选型示例
技术转移阶段，需整理工艺开发报告、设计空间数据等文档，通过验证实验（3-5 批）确认工艺在生产规模的可行性。同时，结合风险评估结果，制定针对性的控制策略，确保澄清工艺满足法规要求，为下游纯化和最终产品质量提供保障。
六、结语
传统上被忽视的澄清工艺，随着生物制药细胞密度和产物滴度的提升，已成为影响产品质量的关键环节。QbD 理念通过系统的风险评估、实验设计和设计空间建立，为澄清工艺的优化提供了科学方法，既能提升杂质去除效率和产物收率，又能增强工艺稳定性和合规性。
未来，随着一次性技术、高通量筛选等技术的发展，QbD 在澄清工艺中的应用将更加深入。生物制药企业需结合产品特性，灵活运用 QbD 工具，优化工艺参数，降低质量风险，推动生物制药行业向更高效、更安全的方向发展。
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