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采用新生大鼠侧脑室注射Shank3干扰慢病毒的方法构建孤独症谱系障碍（ASD）相关 Shank3 基因功能缺失模型。Shank3 是与突触结构和功能密切相关的高风险 ASD 候选基因，其表达下调可模拟孤独症核心行为特征，如社交缺陷、重复刻板行为及认知异常，为机制研究和干预探索提供可靠动物模型。

Shank3干扰慢病毒侧脑室注射造模

选用8只SPF级SD孕鼠，自然分娩后共获得新生仔鼠70只。于出生后第3天（P3），对仔鼠进行右侧侧脑室慢病毒立体定位注射，以构建Shank3基因干扰模型。

根据实验设计，仔鼠随机分为两组：Shank3干扰组：注射1 μL含GFP荧光标记的Shank3特异性shRNA慢病毒；空载对照组：注射1 μL含GFP的空载体慢病毒。

病毒溶液通过玻璃毛细针经微量注射泵缓慢注入右侧侧脑室。注射完成后，将仔鼠置于荧光体视显微镜下，初步观察侧脑室区域GFP信号，确认注射位置准确。为验证病毒转染效率，于注射后第3天（P6），每组随机选取1只仔鼠，断头取脑，制备20 μm厚冰冻冠状切片。在荧光显微镜下（10×物镜）观察发现，Shank3干扰组侧脑室周围细胞均呈现清晰、广泛的GFP荧光表达，表明慢病毒成功感染并有效表达。

仔鼠饲养至P21时进行单笼分养。从全部雄性仔鼠中随机选取40只用于后续实验；若出现不明原因脱毛（可能与应激或个体健康状况相关）则剔除，只选取健康雄性幼鼠（Shank3干扰组与空载对照组各18只）进行行为学实验。

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行为学实验方法

为系统评估Shank3干扰对神经发育及行为功能的影响，本研究在仔鼠P35–P40日龄期间依次开展以下四项标准化行为学测试：

三箱社交实验（Three-Chamber Social Test）：

用于检测社交趋近能力与社交新颖性偏好。实验装置由三个等大相连的透明亚克力箱室组成（每室约20 cm × 40 cm × 22 cm），两侧箱室各放置一个带孔圆柱笼（用于容纳刺激动物或物体）。

社交能力阶段（P35）：将受试大鼠置于中室，适应5 min后开始正式测试。一侧笼内放入陌生同性别SD大鼠（Stranger 1），另一侧放入等体积无生命物体（Object 1）。记录10 min内受试鼠在左右箱室的停留时间及主动嗅探时间。

社交新颖性阶段：紧接着第一阶段，将原Object 1替换为另一只新的陌生大鼠（Stranger 2），其余条件不变。再次记录10 min内受试鼠对熟悉鼠（Stranger 1）与新鼠（Stranger 2）的嗅探时间，评估其对社交新奇刺激的偏好。

旷场实验（Open Field Test）：

用于评估焦虑样行为及一般活动水平。实验在100 cm × 100 cm × 40 cm的黑色不透明方形敞箱中进行（P37）。将受试大鼠轻柔置于箱体中央，自动视频追踪系统记录其10 min内的运动轨迹。主要分析指标包括：

在中央区域（定义为距边缘≥20 cm的正方形区域）与外周区域的停留时间；

总移动距离（反映自发活动能力）。

理毛行为实验（Self-Grooming Test）：

用于量化重复刻板行为。实验于P37在与旷场实验相同的100 cm × 100 cm × 40 cm黑色敞箱中进行。将受试大鼠单独放入箱内，允许其自由探索10 min，全程录像。记录大鼠自我理毛（包括舔前肢、擦拭面部、梳理躯干等连续动作）的总持续时间。

Morris水迷宫实验（Morris Water Maze, MWM）：

用于评估空间学习与长期记忆能力，实验于P38–P42进行。

定位航行训练（P38–P42，共5天）：圆形水池直径120 cm，水深30 cm，水温维持在22 ± 1°C，平台位于西南象限，水面下1 cm不可见。每天将大鼠从四个不同起始象限随机入水一次，限时90 s。若未找到平台，则引导其上台并停留15 s。记录每次找到平台的潜伏期和游泳路径总长度。

空间探索测试（P43）：移除平台，将大鼠从原东北象限入水，自由游泳60 s。记录其穿越原平台所在位置（目标象限内直径15 cm圆形区域）的次数、在目标象限停留时间占比及总游泳距离，以评估空间记忆保持能力。

所有行为实验均在固定时间段（上午9:00–12:00）进行，实验前动物适应测试房间至少30 min。设备在每只动物使用后彻底清洁，避免气味干扰。数据分析采用专业行为学软件。

参考文献：

  • MINAKOVA E, LANG J, MEDEL-MATUS J S, et al. Melanotan-II reverses autistic features in a maternal immune activation mouse model of autism [J]. PLoS One, 2019, 14(1): e0210389.

  • 陈晓芳,王娟,欧萍,等.黑皮质素受体激动剂改善Shank3基因缺陷孤独症模型大鼠行为的机制研究[J/OL].中国比较医学杂志,1-10[2026-01-01].

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