J. Future Foods | 介孔竹炭-金纳米粒子作为载体进行高效的酶固定化|固定化|对酶|活性|竹炭|脂肪酶|载体|金纳米粒子

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Introduction

酶作为天然生物催化剂，凭借高催化效率、高底物特异性及选择性等优势，在绿色生物制造领域展现出巨大潜力，已广泛应用于食品加工、医药、生物燃料等重要行业。然而，天然状态下的酶在工业应用中面临诸多局限，主要体现在操作稳定性低且回收复用成本高，这极大地限制了其规模化应用。酶固定化技术被证实是解决上述问题的有效策略，通过该技术可提升酶的稳定性，增强其对恶劣反应条件的耐受性，并实现酶的多次重复利用。固定化酶的性能很大程度上受固定化方法和载体的影响，因此，开发对酶活性影响小、酶泄漏率低的理想载体和固定化技术成为研究热点。目前，尽管酶固定化研究已取得显著进展，但该领域仍存在载体制备流程繁琐、生产成本高等问题。

竹子作为一种广受欢迎的生物资源，因其生长迅速、生长期短而在中国广泛种植。竹炭（BC）作为一种低成本、环境友好的多孔材料，具有高孔隙率、稳定性和大比表面积等特性，是一种极具潜力的固定化载体。同时，金纳米颗粒（Au NPs）因对酶具有高结合亲和力，成为酶固定化领域的理想辅助材料——酶可通过配体交换过程中的物理吸附牢固结合于 Au NPs 表面，且二者间的强相互作用能有效避免酶泄漏；此外，Au NPs 的良好生物相容性可模拟酶的天然生存环境，最大限度保留酶的活性。

本研究通过金介导的吸附作用，实现了一种简便、直接的酶在竹炭上的固定化方法。以脂肪酶PS为模型酶，对比了含金固定化脂肪酶、游离酶和不含金固定化脂肪酶的性能，证实含金固定化脂肪酶具有更高的活性和稳定性。该方法操作简便、反应条件温和，无需载体合成和有机溶液，所得固定化酶易于从反应溶液中分离，且具有较高的可重复使用性，表明竹炭可作为优良的酶固定化载体，并有望应用于其他酶的固定化。

Results

固定化酶的表征

BC和BC-Au的吸附-脱附等温线如图1A所示，BC和BC-Au都表现出IV型吸附等温线和H3型滞后环，表明存在中孔隙。如图1B所示，可以看出BC-Au的微孔尺寸分布与BC相似，表明BC-Au的微孔结构在沉积过程中保持良好。BC的BET比表面积和微孔体积分别为663.636 m²/g和0.273 cm³/g，而Au NPs的沉积导致部分大孔结构损失，BC-Au的BET比表面积和微孔体积分别降至400.917 m²/g和0.246 cm³/g，平均孔径从BC的3.060 nm略微增大（BC-Au 3.884 nm）。通过SEM测量研究了BC的形貌和得到的BC-Au载体。通过比较BC（图1C）和BC-Au（图1D），在引入Au后，在BC表面可以观察到粒径较大的球形颗粒（图1D），表明纳米金已经成功沉积在BC基体材料上。脂肪酶固定化后，固定化酶（PS@BC-Au）（图1E）的形态与BC-Au载体（图1D）相似，表明固定化过程不会影响BC-Au载体的形态。

图1BC和BC - Au的吸附-脱附等温线（A）、BC和BC-Au的粒径分布（B）及BC（C）、BC-Au（D）和PS@BC-Au（E）的SEM图像

表1 基于吸附-解吸等温线的BC和BC-Au的BET表面积、孔体积和粒径

FTIR谱图结果表明酶成功地固定在BC-Au载体上（图2A）。XRD图谱（图2B）显示，BC在2

为22.4°和42.9°处出现2 个宽衍射峰，对应石墨反射的（002）和（100）晶面，表明BC是典型的无定形碳；BC-Au则清晰观察到Au的4 个典型特征峰，对应（111）、（200）、（220）和（311）晶面，证实Au NPs成功沉积在BC表面；固定化脂肪酶PS后，PS@BC-Au的XRD图谱与BC-Au相似，说明酶的引入未破坏BC-Au载体的晶体结构。 XPS分析（图2C）表明，与BC相比，BC-Au载体的N 1s 和O 1s 峰强度增加，同时出现Au 4f 峰； Au 4f 的精细扫描光谱显示金属Au的4f ₇ / ₂ 和4f ₅ / ₂ 结合能分别为84.1、87.8 eV，表明零价金成功沉积在BC表面（图2D）；酶固定化后，N 1s和O 1s峰强度进一步增加，C 1s峰相对降低（表2）。

图2 BC、BC-Au载体、PS@BC-Au和游离酶的FTIR谱图（A）、XRD图谱（B）和XPS光谱（C、D）

表2 BC、BC-Au载体和PS@BC-Au的表面化学成分

脂肪酶固定化

本研究评估了酶剂量对固定化酶活性和酶负载能力的影响（图3A）。研究发现，酶用量与酶负载量呈正相关。当酶用量增加到250 mg/g时，固定化酶的比活性达到最大值，随后随着酶用量的进一步增加，比活性明显下降，这可能是由于酶在载体表面过度拥挤导致活性降低，因此确定最佳酶用量为250 mg/g。

图3 酶剂量（A）和固定时间（B）对酶负载能力和比活性的影响

固定化时间对固定化酶活性和酶负载量的影响研究表明（图3B），当固定化时间延长至1 h时，固定化酶的活性和酶负载量均增加，进一步延长固定化时间，二者均无显著变化，因此选择1 h作为固定化时间。在最佳条件下（酶用量250 mg/g，固定化时间1 h），所得固定化酶活性、酶负载量和酶固定化效率分别为513.5 U/g、234.78 µg/mg和93.9%。

pH和温度对游离酶和固定化酶活性的影响

研究了pH值和温度对游离酶和固定化酶PS@BC-Au活性的影响（图4）。温度对酶活性的影响研究显示，游离酶的最适温度为40°C，而PS@BC-Au在50°C时表现出最高活性。pH对酶活性的影响研究表明，游离酶和PS@BC-Au均在pH 8.0时表现出最大活性。在pH 6.0时，PS@BC-Au保留了超过70%的残余活性，而游离酶在相同pH下仅保留54.5%的活性；在较高pH值下，PS@BC-Au的活性也高于游离酶。

图4 温度（A）和pH值（B）对游离酶和固定化酶相对活性的影响

游离酶和固定化酶的热稳定性

由图5A可知，随着孵育时间的延长，游离酶和固定化脂肪酶的活性均下降，但固定化脂肪酶的失活速率比游离酶低。游离酶在50°C孵育180 min活性降低50%，而PS@BC和PS@BC-Au在相同时间后分别保留64.4%和72.4%的初始活性，表明固定化酶比游离酶更稳定。如图5B所示。可以看出，PS@BC-Au的活性半衰期达到362.8 min，是游离脂肪酶（185.3 min）的2 倍左右。此外，与PS@BC相比，PS@BC-Au的半衰期增加了32%（275.0 min）。

图5 游离酶和固定化酶在50 °C下的热稳定性（A）、游离脂肪酶、PS@BC和PS@BC-Au的半衰期（B）及PS@BC和PS@BC-Au的特异性活性（C）和可重复使用性（D）

酶的动力学分析和比活性

如表3所示，PS@BC-Au显示Kₘ为0.672 8 mmol/L，低于游离酶。此外，PS@BC-Au与PS@BC的比较显示，PS@BC-Au具有更低的

K

ₘ 和更高的Kcat。该结果也与酶特异性活性测定的结果一致（图5C）。

表3 游离酶和固定化酶的动力学参数

固定化酶的可重复使用性

如图5D所示，随着固定化酶循环数的增加，PS@BC-Au和PS@BC的活性逐渐降低。PS@BC-Au和PS@BC的相对活性在63 个循环后分别保留了9.47%和1.10%。

Conclusion

本研究建立了一种简单、绿色的酶固定化方法。以具有多孔结构、高孔隙率和低成本的天然材料竹炭（BC）为载体，先在其表面包覆金颗粒，然后通过金介导的吸附作用实现酶的固定化。该固定化酶的合成条件简单温和，且完全基于水相体系。所得产物PS@BC-Au具有良好的催化活性（513.5 U/g）、高负载效率（94%）和较强的环境耐受性。此外，PS@BC-Au的稳定性分别约为 PS@BC 和游离酶的1.3、2 倍。动力学研究表明，在固定化体系中引入Au可以提高酶与底物的亲和力和催化效率，Au良好的生物相容性可以进一步改善固定化酶的微环境，使PS@BC-Au的相对活性比PS@BC提高了132%。同时，PS@BC-Au表现出良好的可重复使用性，经过10 个循环后仍保留63.9% 的初始酶活性，提高了生物催化工业应用的成本效益。综上所述，本研究提供了一种简单、高效、经济且环境友好的酶固定化方法，具有广阔的应用前景。

Mesoporous bamboo charcoal-gold nanoparticles as a support for efficient enzyme immobilization

Guihong Yao a b, Yun Lingab, Tong Liuab, Shige Xingab, Meiyi Yaoab, Wei Guoab, Feng Zhangab*

a

Institute of Food Safety, Chinese Academy of Inspection & Quarantine, Beijing 100176, China

b

Key Laboratory of Food Quality and Safety, State Administration for Market Regulation, Beijing 100176, China

*Corresponding authors.

Abstract

Herein, a green and facile enzyme immobilization method was developed by immobilizing enzymes on the bamboo charcoal (BC) through gold-mediated adsorption under mild conditions (no organic solvents were required). Lipase PS was used as the model enzyme, and the obtained immobilized lipase (PS@BC-Au) exhibited a high immobilization efficiency (93.9%) and enzyme loading capacity (234.78 µg/mg). The half-life of PS@BC-Au was found to be 362.8 min, which is approximately 1.3 and 2 times longer than that of the free enzyme (185.3 min) and the immobilized enzyme without gold (PS@BC, 275.0 min). Furthermore, PS@BC-Au and PS@BC exhibited up to 63.9% and 47.1% of residual activity after 10 cycles, respectively. Interestingly, the gold nanoparticles in the immobilized system can improve the catalytic efficiency. Consequently, BC, with its porous structure, good stability, large surface area, low cost, and environmental-friendly properties, can serve as a promising support for enzyme immobilized application.

Reference:

YAO G H, LING Y, LIU T, et al. Mesoporous bamboo charcoal-gold nanoparticles as a support for efficient enzyme immobilization[J]. Journal of Future Foods, 2026, 6(2): 244-250. DOI:10.1016/j.jfutfo.2024.09.005.