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Introduction
随着全球老龄化趋势的加剧，人们越来越关注与老龄化相关的社会压力和经济负担的增加。多种神经退行性疾病证明，衰老过程会对大脑功能产生深远影响。因此，研究衰老机制和开发有效的抗衰老产品对于保持健康生活方式至关重要。研究表明，细胞代谢过程中产生的ROS或自由基导致的氧化损伤和线粒体功能障碍是加速衰老的主要因素。随着年龄的增长，人体的内源性抗氧化能力下降，加剧了ROS生成和消除之间的失衡。此外，提高抗氧化能力和维持线粒体的正常功能可能是缓解衰老相关症状的有效策略。
核因子E2相关因子2（Nrf2，NFE2L2）对调节机体抵抗氧化应激的能力至关重要。当面临氧化应激时，Nrf2会从Kelch-like ECH-associated protein 1 （Keap1）中释放并被转运至细胞核，与抗氧化反应元件（antioxidant response elements，AREs）结合并调节多个细胞保护基因的转录，包括血红素加氧酶-1（HO-1）和NADPH：醌氧化还原酶 1（NQO1）。大量报告表明，Nrf2途径受损可能导致衰老加速。以Nrf2信号通路为靶点作为减轻氧化应激的一种手段，可能是缓解与年龄有关的症状（如记忆损伤和认知功能障碍）的一种潜在策略。
核桃是一种传统的健康食品富含丰富的脂肪酸和不皂化物（USM）。由于核桃油中含有大量植物甾醇、生育酚、角鲨烯和多酚类物质，具有很强的抗氧化性，因此核桃油中的不皂化物备受关注。Liao等人报道核桃油可抑制氧化应激并防止小鼠大脑记忆受损，而从米糠中提取的不皂化物可显著激活HepG2细胞中的抗氧化酶活性，从而改善氧化损伤。然而，从核桃油中提取的不皂化物对衰老症状的影响还缺乏研究。本研究旨在评估不皂化物对D-半乳糖处理的小鼠的抗衰老特性，并探讨其对PC12细胞的潜在作用机制。结果表明，不皂化物可减轻D-半乳糖引起的行为障碍、神经损伤和氧化应激并通过激活Nrf2信号通路调节抗氧化防御系统发挥抗衰老作用。
Results and Discussion
核桃油中不皂化物对衰老小鼠行为的影响
新物体识别实验旨在评估实验动物的短期记忆能力。实验结果显示，小鼠对物体A和B的平均探索时间和探索次数无显著差异。D-半乳糖处理明显减少了小鼠在目标区域的探索时间和次数，这表明小鼠的短时记忆能力受损。然而，阳性对照组（100 mg/kg VE）和高剂量组（400 mg/kg不皂化物）使小鼠探索时间分别显著增加了36.00%和30.81%。此外，与模型组相比，阳性对照组（100 mg/kg VE）和高剂量组（400 mg/kg不皂化物）的探索次数分别增加了23.49%和21.16%。这些研究结果表明，不皂化物显著改善衰老小鼠的短期记忆损伤。
莫里斯水迷宫（MWM）是研究小鼠空间学习和记忆能力的经典模型。实验结果显示，对照组小鼠在第1天的逃逸潜伏期为（43.85 ± 0.68）s，明显长于第5天的（17.99 ± 0.64）s，表明衰老模型构建成功。不皂化物处理组后增加小鼠在目标区域的停留时间，降低逃逸潜伏期，小鼠的运动轨迹相对集中，不皂化物有效改善衰老小鼠的空间记忆和学习记忆障碍。
图1 不皂化物对小鼠行为的影响
不皂化物对小鼠大脑神经元损伤的影响
海马区是大脑的重要区域，在认知过程中发挥着不可或缺的作用，神经元的有序排列是学习和记忆能力的结构基础。采用H&E染色法研究不皂化物对氧化应激诱导的海马神经元损伤和组织病理学变化的影响。图2结果表明，不皂化物能够有效改善神经细胞变性、数量减少、细胞排列紊乱、核仁不清的现象，减轻衰老小鼠的脑组织损伤。
图2 不皂化物对小鼠脑组织的影响
不皂化物对衰老小鼠突触功能的影响
海马突触的可塑性对认知功能至关重要。不皂化物处理后小鼠突触明显增加了PSD95的长度和宽度。此外，不皂化物处理可明显上调衰老小鼠PSD95 mRNA的表达水平。PSD95是一种关键的突触后密度蛋白，其高水平表达可促进突触传递。不皂化物可减轻D-半乳糖诱导的小鼠大脑突触功能障碍。
图3 不皂化物对小鼠突触功能的影响
不皂化物对衰老小鼠海马区线粒体的影响
线粒体对神经元的发育和突触可塑性的调节至关重要。研究结果显示，不皂化物处理后改善衰老小鼠海马区线粒体的异常超微结构，降低线粒体异常比例，增加线粒体中NRF-1、PGC-1α和TFAM的mRNA表达水平。这些研究结果表明，不皂化物改善衰老小鼠海马神经元的线粒体功能并促进线粒体的生物生成。
图4 不皂化物对小鼠海马区线粒体的影响
不皂化物对衰老小鼠大脑氧化应激的影响
线粒体受损会导致ROS水平异常升高，进而引起机体内的氧化应激。结果显示，不皂化物提高抗氧化酶（GR、SOD、CAT和GPX）的活性，分别提高60.52%、26.78%、39.06% 和25.81%，同时MDA浓度降低30.28%。研究结果表明，不皂化物具有抑制氧化应激的能力，这与其抗衰老机制密切相关。
图5 不皂化物对小鼠大脑氧化应激的影响
不皂化物对衰老小鼠大脑中Keap1/Nrf2抗氧化信号通路的影响
不皂化物对衰老小鼠进行干预后显著降低Keap1的基因和蛋白表达水平，而Nrf2在细胞质和细胞核中的表达均显著上调，Nrf2在细胞质中积累，然后转入细胞核，激活HO-1和NQO1等抗氧化基因和蛋白。这些研究结果表明，不皂化物通过Nrf2/Keap1途径激活衰老小鼠的抗氧化防御系统，发挥抗氧化作用。
图6 不皂化物对小鼠大脑中Keap1/Nrf2抗氧化信号通路的影响
不皂化物对D-半乳糖处理的PC12细胞氧化状态的影响
不皂化物能够增加衰老细胞中线粒体膜电位（MMP），降低衰老细胞中ROS和MDA的浓度。同时增加抗氧化酶（CAT、SOD、GPX和GR）的活性，分别为26.78%、60.52%、25.81%和39.06%，表明不皂化物能够保护细胞免受氧化损伤。
图7 不皂化物对PC12细胞氧化状态的影响
不皂化物对D-半乳糖处理PC12细胞中Keap1/Nrf2抗氧化信号通路的影响
不皂化物干预后D-半乳糖处理的PC12细胞中Nrf2和Keap1的基因表达水平显著下降，HO-1基因表达水平显著上升。同时不皂化物下调Keap1蛋白的表达，增强Nrf2在细胞质中的积累，并促进其向细胞核的转位，激活下游抗氧化酶NQO1和HO-1的蛋白表达。研究结果表明，不皂化物通过激活Nrf2通路来调节细胞内的抗氧化能力，延缓细胞的衰老。
图8 不皂化物对PC12细胞细胞中Keap1/Nrf2抗氧化信号通路的影响
Conclusion
不皂化物能够缓解衰老小鼠的短期记忆和空间学习记忆能力障碍，缓解神经元损伤，改善线粒体超微结构，促进线粒体生物发生，缓解线粒体功能障碍。不皂化物通过激活Nrf2信号通路，增强下游抗氧化酶（HO-1、NQO1）的表达，发挥抗氧化能力，减缓衰老导致的氧化应激。为核桃油中不皂化物作为延缓衰老的功能性食品的开发和利用提供理论依据。
第一作者简介
宏丹，北京工商大学食品与健康学院博士研究生，主要研究方向为主要研究方向为功能性食品的筛选及生物活性作用机制研究。
通信作者简介
贾英民，男，北京工商大学食品与健康学院教授，博士生导师。国务院特殊津贴专家、教育部食品科学与工程类教学指导委员会委员、食品科学技术学会常务理事。主要从事酶与蛋白质工程、食品微生物研究。先后主持“十三五”国家重点专项子课题、“十二五”科技支撑计划项目、国家自然科学基金、北京市自然-市教委合资项目等多项重要研究项目；在Critical Reviews in Food Science and Nutrition, JAFC等国内外期刊发表学术论文100余篇；取得国家发明专利十余项；曾获得省部级科技进步一等奖2项，科技进步二等奖2项；主持“食品微生物学”省级精品课程建设，并获得河北省优秀教学成果一等奖1项；主编国家十五规划教材和面向21世纪教材各一部。
Unsaponifiable matter from walnut oil ameliorate memory deficits and mitochondrial dysfunction in aging mice via activating Nrf2 signaling pathway
Dan Honga, Xiao Xiaoa, Aijin Maa, Zhou Chena, Siting Lia, Junxia Xiab,c,d, Yiling Tiane, Yingmin Jiaa,*
a School of Food and Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China
b Hebei Yangyuan Zhihui Beverage Co., Ltd., Hengshui 053000, China
c Institution of Chinese Walnut Industry, Hengshui 053000, China
d Hebei Key Laboratory of Walnut Nutritional Function and Processing Technology, Hengshui 053000, China
e College of Food Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, China
*Corresponding author.
Abstract
Aging is an inevitable biological phenomenon that involves a multitude of physiological alterations. Dietary interventions are being considered as potential strategies for delaying age-related dysfunction. Unsaponifiable matter (USM), a composition of highly active ingredients found in walnut oil, has demonstrated antioxidant effects. This study aims to explore the neuroprotective effects of USM on D-galactose-treated C57BL/6 mice and elucidate its underlying mechanism, which was validated in PC12 cells treated with D-galactose. The results of behavioral tests demonstrated that USM significantly improved cognitive deficits associated with aging. The morphological analysis demonstrated that USM effectively alleviated hippocampal neuronal damage, synaptic impairment, and mitochondrial dysfunction induced by D-galactose. Furthermore, USM significantly increases the antioxidant enzymes activity while reducing the malondialdehyde and reactive oxygen species levels. The results suggest that USM can mitigate age-related symptoms caused by D-galactose by activating the nuclear factor erythroid-2-related factor 2 signaling pathway, which enhances the expression of antioxidant enzymes, restore redox balance, and improves synaptic and mitochondrial functions. This has a positive on improving cognition and memory disorders in elderly mice.
Reference:
HONG D, XIAO X, MA A J, et al. Unsaponifiable matter from walnut oil ameliorate memory deficits and mitochondrial dysfunction in aging mice via activating Nrf2 signaling pathway[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(3): 9250093. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250093.
编译内容由作者提供
编辑：王佳红；责任编辑：孙勇
封面图片：图虫创意
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