超高压处理（HPP）作为一种非热加工技术，因其能有效保留橙汁的感官特性与营养成分而备受关注。然而，HPP在橙汁工业化生产应用中仍面临两大瓶颈：一是果胶甲酯酶（PME）的残留会导致果胶脱甲酯化反应，引发橙汁浊度损失；二是对耐压微生物芽孢的灭活效果不足，需依赖冷链贮藏以保障安全性。
近年来，许多研究聚焦于单一因素（如压力或温度）对PME活性的影响。现有的研究对多因素协同作用于PME活性的系统性分析仍存在空白，尤其缺乏从分子构象动态角度解析微环境与温度、压力处理交互效应的研究。
昆明理工大学食品科学与工程学院的刘祝银、李彦潼、易俊洁*等以柑橘PME及其分别通过大肠杆菌和毕赤酵母异源表达的重组PMEI为研究对象，聚焦pH值、 Ca 2+ 浓度及果胶底物等微环境因素，并结合温压协同技术（HPP/25、60 ℃），系统探究其对酶活性和结构的影响机制。通过圆二色光谱、荧光光谱与分子动力学模拟等手段，解析PME的二级/三级结构变化及PMEI的构象适应性。本研究旨在揭示微环境通过调控酶-抑制剂构象动态增强温压协同效应的分子机制，为开发靶向抑制PME的橙汁非热加工技术提供理论支撑。
1 温压作用下微环境变化对PME和PMEI活性的影响
1.1 Ca2+浓度对PME和PMEI的抑制作用
如图1所示，在HPP/25 ℃处理条件下，当Ca2+浓度在0.1～0.5 mol/L范围时，PME几乎完全失活（
P＜0.05）。从作用机制来看， Ca 2+ 在高压环境下可能通过与PME活性中心的特异性结合，导致酶蛋白构象发生不可逆改变，从而实现了在常温条件下使PME完全失活；从工艺优化角度来看，该结果证实无需采用更高温度（60 ℃）的温压协同处理即可达到PME完全失活的效果。基于此发现，若继续进行温压协同实验将面临双重问题：一方面，从实验设计的科学性考量，在已确定常温条件下HPP结合 Ca 2+ 即可实现目标，额外的高温处理实验缺乏明确的科学依据；另一方面，从研究效率角度评估，实验会造成人力、物力和时间资源的浪费，更会偏离本研究“建立PME最适失活方案”核心目标。因此，考虑到实验结果的科学性和实用性，决定终止后续的光谱分析实验。
1.2 果胶浓度对PME和PMEI活性的影响
如图2A所示，在橙汁中典型的果胶体积分数范围（0.1%～0.5%）内，PME活性不稳定。值得注意的是，在此浓度区间内，PME的基础活性已处于较低水平。由图2B可知，在未进行HPP的情况下，仅通过添加PMEI即可完全抑制PME活性。此外，当果胶浓度超过此范围时，体系黏稠度显著增加，这种物理性质的改变会严重影响PME的催化活性。在生理相关浓度范围内果胶对PME活性无显著调节作用；同时PMEI在常规条件下已能完全抑制PME活性；此外，高浓度果胶引起的物理干扰会掩盖真实的酶学调控机制，因此不进行后续的光谱分析实验。
1.3 pH值对PME和PMEI活性的影响
图3系统展示了不同pH值条件下各处理组对PME活性及PMEI抑制率的影响特征。如图3A所示，在强酸条件下（pH 3.0）未处理PME活性最低，随着pH值升高到弱酸性至中性范围（pH 5.0～7.0）时活性达到峰值，这一变化趋势与柑橘类水果PME的最适pH值范围一致。值得注意的是，经HPP处理的实验组，特别是HPP/60 ℃处理组，其酶活性在各pH值条件下均显著降低（
P＜0.05），且在pH 7.0时几乎完全失活，残留活性不足5%，这一现象不仅证实了高压处理对PME活性的抑制作用，更揭示了温度与压力的协同增效作用。如图3B、C所示，对于重组PMEIs，
E.PMEI和
P.PMEI表现出相似的趋势，2 种抑制剂在pH 3.0～7.0范围内均保持较高抑制率，但HPP处理组的抑制效果较对照组显著提升10%，这一差异可能源于高压处理诱导的PME构象变化暴露出更多抑制剂结合位点，或增强了酶与抑制剂之间的分子相互作用。相比于
P.PMEI，原核系统表达的
E.PMEI展现出更好的稳定性，这种差异可能与其分子结构的均一性、糖基化修饰程度以及原核表达系统中分子伴侣的保护作用等多重因素相关。
进一步的机理分析表明，PME的失活过程可能涉及以下分子机制：高压处理导致酶分子内部疏水核心的破坏，温度升高加速了活性中心关键氨基酸残基的构象改变，而中性pH值环境则最有利于这些结构变化的发生。在中性条件下采用HPP/60 ℃处理联合
E.PMEI抑制剂，可实现对PME活性的抑制率超过95%，表明温压协同处理在构象调控与酶活性钝化方面具有显著优势。尽管橙汁的天然pH值通常为3.4～4.2，工业应用中可通过缓冲液调节果浆pH值将其控制在5.5～6.0的适宜范围，同时加入
E.PMEI后进行HPP/60 ℃处理，最终再调回酸性以确保品质与安全。该路径不仅充分利用了PME构象对pH值的敏感性，也为果汁行业提供了一种科学合理、可工业化推广的非热失活新策略。
以上研究表明，PME和PMEI的活性及稳定性在不同pH值以及不同温压协同处理条件下表现出显著差异，这可能与其分子表面的带电基团分布和氢键网络的重排密切相关。值得注意的是，HPP和温度处理可能通过协同作用放大pH值对蛋白质构象的影响，进而导致其功能特性的显著改变。基于这些发现，本实验针对pH值影响需要开展对PME和PMEI的二级和三级结构研究，以阐明其分子作用机制。相比之下，由于初步实验显示 Ca 2+ 浓度和果胶底物含量对PME活性影响不显著，故未继续进行相关结构研究。
2 温压协同pH值对PME和PMEI二级结构的影响
2.1 PME二级结构的变化
如图4所示，PME的二级结构组成受pH值环境与HPP条件的显著调控。在pH 3.0条件下，各处理组均呈现典型的无序结构特征，其中无规卷曲相对含量达40%以上，而HPP/25 ℃与HPP/60 ℃组间的结构差异不显著。在中性环境（pH 7.0）下观察到最显著的结构重排现象：相较于对照组，HPP/60 ℃处理使
-折叠结构的相对含量从22%提升至29%，同时导致-螺旋结构的相对含量从22%降至12%，这表明高压处理可能通过破坏PME的疏水核心区域诱导部分-螺旋向-折叠转化。值得注意的是，在pH 11.0的强碱性条件下，所有处理组的二级结构含量无显著变化，可能是因为极端pH值通过电荷排斥作用掩盖了高压处理的效应。总而言之，高压处理对PME的构象调控具有显著的pH值依赖性，其中pH 7.0条件下的二级结构转变最为显著，调控-折叠与-螺旋的相互转化。
2.2 PMEI二级结构的变化
如图5所示，
E.PMEI的二级结构受pH值和HPP影响较大。在pH 3.0和pH 11.0条件下，
E.PMEI主要呈现-折叠（48%～51%）和无规卷曲（39%～42%）结构，HPP对其影响较小。然而在pH 7.0时，HPP引起显著的结构重排，对照组以-螺旋为主（94%），而HPP/25 ℃和HPP/60 ℃处理分别使-折叠相对含量增加至52%和25%，同时-螺旋相对含量降低甚至几乎完全消失。虽然HPP在不同pH值条件下显著改变了
E.PMEI的二级结构，特别是中性条件（pH 7.0）下-螺旋向-折叠的显著转化，但这些构象变化并未影响其抑制PME的活性。这可能归因于以下3 个方面：1）
E.PMEI的活性中心位于结构稳定的核心区域，HPP诱导的构象变化主要发生在
E.PMEI的伴侣蛋白区域；2）关键活性残基的微环境在构象转变中保持完整；3）抑制剂与酶的特异性结合主要依赖于局部短肽序列而非整体构象。上述结果表明，
E.PMEI是一种结构柔性但功能稳定的抑制剂，其抑制活性对加工处理条件具有较强的耐受性。
如图6所示，
P.PMEI的二级结构受pH值和HPP的显著调控。在pH 3.0时，HPP/60 ℃处理使
P.PMEI的-螺旋相对含量从7%骤增至97%，而其他组以无规卷曲（48%～53%）和-折叠（30%～38%）为主。在pH 7.0条件下，HPP/25 ℃处理诱导-螺旋显著形成（52%），而HPP/60 ℃组则呈现-折叠（50%）和无规卷曲（38%）的混合构象。值得注意的是，在pH 11.0时各处理组均保持以-折叠（46%～50%）为主的稳定结构。这些结果说明HPP/60 ℃在酸性条件下能诱导
P.PMEI发生-螺旋化，在中性pH值时HPP协同的温度差异导致构象分化，同时碱性环境下
P.PMEI构象较完整。
3 温压协同pH值对PME和PMEI三级结构的影响
3.1 PME三级结构的变化
如图7所示，在pH 3.0时，与对照组相比，HPP/25 ℃和HPP/60 ℃处理分别使PME的荧光强度峰值降低约35%和60%，且HPP/60 ℃处理的效果更为显著。中性条件（pH 7.0）下也观察到类似趋势，HPP/60 ℃组的荧光强度较对照组下降达55%，显著高于HPP/25 ℃组的30%降幅。而在碱性环境（pH 11.0）下，HPP仅使荧光强度轻微降低，各组间差异较小。这些结果表明温压协同pH值处理通过改变PME的色氨酸微环境或分子构象导致荧光猝灭，且处理温度与荧光强度降低程度呈正相关。同时在酸性至中性条件下温压协同pH值处理对PME结构的影响更为显著。
3.2 PMEIs三级结构的变化
如图8所示，在酸性条件（pH 3.0）下，相较于HPP/25 ℃，HPP/60 ℃处理使
E.PMEI荧光强度增加。在中性环境（pH 7.0）时，2 种温度条件下HPP均导致荧光强度降低，其中HPP/60 ℃组的猝灭效应（降低35%）显著强于HPP/25 ℃组。值得注意的是，在碱性条件（pH 11.0）下，HPP/60 ℃组表现出最强的荧光猝灭作用。这些结果表明温压处理在各pH值条件下均引起不同程度的荧光猝灭，提示其可能通过改变微环境极性影响发色团，而HPP/60 ℃处理在酸性条件下可能通过暴露色氨酸残基增强荧光，而在中碱性条件下则因结构紧缩导致荧光猝灭。
如图9所示，在不同pH值条件下，各处理组对
P.PMEI荧光强度的影响无显著差异。然而，pH值对荧光强度具有显著影响，其中在pH 7.0中性条件下的荧光强度最高，较pH 3.0酸性条件提高了约25.3%，较pH 11.0碱性条件提高了约18.7%。由此可以推断出中性环境有利于维持色氨酸残基的最适微环境，当pH 7.0时
P.PMEI的构象稳定性最佳。
结 论
本研究围绕HPP协同温度处理下微环境因素对柑橘PME及其抑制剂（PMEI）结构与功能的调控机制展开系统探讨。结果表明，Ca2+在常温HPP（600 MPa/25 ℃）条件下即可实现PME活性的完全抑制，而在果胶体积分数为0.01%～3%条件下，PME活性不稳定，高浓度则可能引发体系过黏稠，限制其应用。在pH 7.0条件下，HPP/60 ℃处理可显著降低PME活性（抑制率＞95%），并诱导其发生
-螺旋减少、-折叠增加的构象重排，伴随色氨酸微环境极性变化，表明温压协同处理在中性条件下对PME构象及活性具有显著调控效应。根据前期研究，分别从大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母菌中表达出足量的重组PMEI。结果发现不同来源PMEI对pH值的响应特性存在差异。E.PMEI在pH 7.0条件下发生明显的-螺旋向-折叠转化，但仍保持抑制活性稳定；
P.PMEI在酸性条件下-螺旋增加并伴随抑制效率提升，显示出构象变化与功能增强之间的相关性。综上，温压协同处理与微环境因子可通过影响PME及PMEI的构象实现对酶活性的精准调控。本研究不仅有助于丰富果胶酶-抑制剂体系构效机制的理论认知，也可为开发低能耗、高品质的果汁非热稳浊加工新技术提供理论依据和实践参考。未来的研究可以进一步探索不同来源PMEI的特性和应用潜力，以及微环境因素在其他食品酶体系中的调控作用。
作者简介
通信作者
易俊洁 教授
易俊洁，昆明理工大学食品科学与工程学院教授，博士生导师，担任昆明理工大学果蔬加工与营养健康团队负责人，云南省高原特色食品预制化重点实验室主任，云南省高校果蔬加工工程技术研究中心主任，昆明市绿色食品加工国际对外科技研发中心主任。入选中国科协“青年人才托举”工程、“强国青年科学家”引领计划、云南省“高层次引进人才”青年人才专项，获得云南省优秀青年基金资助，被评为轻工类全国先进工作者、云南省青年五四奖章、云岭最美科技人、云南省“创新之星”等。兼任中国食品科学技术学会青年工作委员会副秘书长、全国青联委员、中国青科协委员、云南省现代农业产业技术体系蔬菜加工岗位科学家、云南省食品安全风险评估专家委员会委员等。研究方向为果蔬加工关键技术研究及产业化应用，与多家食品加工龙头企业建立长期合作，并担任云南省首届科技副总和企业首席科学家。主持国家自然科学基金、省重大科技专项等科研项目46 项，发表研究文章148 篇（含ESI热点论文1 篇，高被引论文6 篇），牵头/参与制定国家、行业等标准26 项，申请/授权发明专利58 件，担任《Food Frontiers》副主编、《Food Chemistry International》副主编，《Food Bioengineering》《eFood》《食品工业科技》《食品科学》《食品科学技术学报》《食品与生物技术学报》和《中国果菜》青年编委。
引文格式：
刘祝银, 李彦潼, 江永利, 等. 温压协同微环境对柑橘果胶甲酯酶与抑制剂的影响机制[J]. 食品科学, 2025, 46(22):92-100. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250427-219.
LIU Zhuyin, LI Yantong, JIANG Yongli, et al. Mechanism for the effect of high pressure processing at different temperatures combined with microenvironment on citrus pectin methylesterase and its inhibitor[J]. Food Science, 2025, 46(22): 92-100.(in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250427-219.
实习编辑：甘冬娜；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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