Cell Stem Cell | 3D打印“细胞小屋”助力体外培养工程化造血干细胞|dna|stem|克隆|细胞|骨髓

撰文|亦

以患者自身的造血干细胞和祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）作为“治疗对象”和“治疗载体”的基因治疗方法为多种遗传性血液疾病提供了“一次性治愈”的希望【1-2】。然而，在体外培养和基因编辑过程中，HSPCs常会遭遇DNA损伤、氧化应激、过早分化等功能丧失问题，这严重影响了治疗的安全性与长期效果【3-5】。传统的二维（2D）培养系统无法模拟体内骨髓微环境的机械与结构支持，导致干细胞功能在体外迅速下降。

近日，意大利米兰圣拉斐尔科学研究所Raffaella Di Micco团队在Cell Stem Cell上发表题为Nanoengineered 3D culture substrate enables superior persistence and polyclonal engraftment of genetically engineered hematopoietic stem cells的文章。提出使用一种名为 “nichoids” 的纳米工程化3D培养基底，为HSPCs提供类似体内的机械支持，旨在减少培养引起的应激反应，维持干细胞特性，并提高基因编辑后的植入效率。

研究团队设计的 n ichoids是一种通过高精度双光子激光3D打印技术，使用生物相容性树脂（SZ2080）在玻璃片上制造的、具有规则微观架构的刚性人工三维支架，专门设计用于在体外培养中模拟和支持细胞的生长与功能。为了验证nichoids能否在体外培养期间为造血干细胞提供机械支持，从而增强其功能，作者将其与传统2D培养进行比较。发现3D培养显著增加了混合集落（来源于更原始、多能性细胞）的输出，单细胞来源的集落中所含谱系数量有增加趋势，且集落细胞数量更高。小鼠移植实验显示，3D组显示出更高的克隆形成能力。以上说明 Nichoids能显著增强HSPCs在体外培养后的功能，证明3D信号在维持干细胞特性中起关键作用。

随后，为阐明nichoids增强HSPCs功能的分子和细胞机制，研究者分析了其引起的转录组变化，并观察了对细胞形态、骨架和核结构的影响。转录组分析发现3D培养显著重塑HSPCs转录谱，上调细胞外基质、粘附和细胞骨架相关通路，下调DNA复制、细胞分裂和氧化呼吸等通路。3D培养的HSPCs在第7天增殖更慢，氧化应激更低，DNA损伤更少，p38 MAPK激活减少。形态上，3D培养的HSPCs体积更小、更接近球形，且3D细胞的微管蛋白呈现极化或对称分布。以上说明 nichoids通过机械生物学调控，防止了2D培养导致的细胞形变和核挤压，维持了核形态和微管蛋白极性，从而减少了增殖压力、氧化应激和DNA损伤，保留了干细胞特性。

那么nichoids预培养能否改善涉及额外操作压力的基因编辑流程，并提升编辑后HSPCs的长期植入能力呢？通过将2D/3D预培养的细胞分别进行基因编辑，作者发现nichoids预培养不影响编辑效率，且提高了编辑后细胞的混合集落输出。在移植实验中，3D预培养组小鼠在外周血、骨髓和脾脏中的人源细胞嵌合率更高。二次移植结果显示，3D组在所有造血器官中的植入均更高，且HDR编辑细胞的百分比增加了3-6倍。值得注意的是，在mPB来源的HSPCs中使用碱基编辑（ABE8.20-m）和引物编辑（PE3max）敲除B2M基因，也观察到相似的体外结果。以上说明 nichoids支持跨多个平台（Cas9/AAV6，BE，PE）的高效基因编辑，并通过维持功能性干细胞池，显著提高了编辑后HSPCs的长期重建能力。

现有的大多数已上市或后期开发的HSPCs基因疗法依赖于慢病毒介导的基因添加，于是作者测试了nichoids能否进一步优化这类临床相关方案。实验室结果提示3D培养不影响细胞活力和转导效率，可提高转导后细胞的红系和混合集落形成潜能。移植后，3D组小鼠在外周血、骨髓和脾脏中的人源嵌合率更高。3D组的估计克隆群体规模更大，克隆多样性更高，且未在癌基因或抑癌基因位点出现常见整合位点的富集。这说明即使短暂的36小时nichoids培养，也能提高慢病毒基因添加后HSPCs的植入能力和克隆多样性，且不增加基因毒性风险。来自临床WAS（Wiskott-Aldrich综合征）患者的细胞实验证实， 3D培养能增强WAS患者来源的基因校正HSPCs的植入能力和克隆复杂性，为更安全、更有效的临床应用提供了支持。

总的来说，该研究提出了一种创新且可转化的3D培养策略，能够显著提升造血干细胞基因治疗的安全性与有效性，尤其适用于需要长期植入和多克隆重建的临床场景。这一平台技术有望推动更多基因治疗从实验室走向临床应用。

https://doi.org/10.1016/j.stem.2025.12.016

制版人：十一

参考文献

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（*排名不分先后）