J Med Virol丨警惕FRET筛选方法陷阱，筑牢抗病毒药物发现的第一道防线|底物|抗病毒药|活性|荧光|蛋白酶|高通量

新冠病毒主蛋白酶在调控病毒复制与免疫逃逸过程中发挥了重要作用，使其成为抗病毒药物开发的理想靶标之一。在抗病毒药物研究中，研究者主要使用荧光共振能量转移（ FRET ）筛选方法进行主蛋白酶抑制剂的高通量筛选。然而，在对已报道的主蛋白酶抑制剂进行再评价研究时，发现先前诸多研究存在假阳性结果。重新审视和反思 FRET 筛选方法的实验设计迫在眉睫。

近日，皖南医学院陈云雨博士团队在 Journal of Medical Virology 发表了题为

Fluorescence Resonance Energy Transfer Assay at the Crossroad: Urgent Reexamination of Assay Design for Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Main Protease Inhibitors

的警示性评论。评论指出，由于广泛存在的方法学设计缺陷，FRET筛选可能正在产生相当比例的假阳性结果，这些问题应得到研究者的充分重视，为抗病毒药物发现重建“可靠起点”

1. 被忽视的三大“陷阱”

陷阱一 : 酶的“活性之谜” 。主蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶，其活性严格依赖于同源二聚体结构。然而，许多研究中表达的主蛋白酶通常在其氨基端融合有多聚组氨酸等标签，这将严重破坏蛋白酶的催化活性。高活性蛋白酶的制备是蛋白酶抑制剂高效筛选的重要基础。

陷阱二 : 环境的“隐形干扰” 。白桦酸等天然产物能产生典型的胶体聚集效应，可以非特异性抑制蛋白酶活性，产生假抑制信号。槲皮素等天然产物具有荧光淬灭特性，会直接干扰荧光信号读数的真实性，导致假阳性结果。遗憾的是，在先前的诸多研究中，这些干扰因素在 FRET 筛选方法中并未得到研究者的充分重视。因此，在酶促反应条件优化的基础上，在反应缓冲液中适量加入 EDTA 、 DTT 和去污剂等组分是非常必要的。

陷阱三 : 分析的“逻辑陷阱” 。在 FRET 筛选方法中，许多研究者利用非线性酶促反应终点和起点间的相对荧光值之差计算酶抑制率，导致假阳性结果。研究者基于酶促反应的初速度进行酶抑制活性分析是至关重要的。此外，苗头化合物还需利用多种生化方法严格地进行酶抑制活性评价研究。

2. FRET筛选方法的全新替代方案:荧光底物水解法

面对传统 FRET 筛选方法的固有缺陷，研究团队设计了一项创新性替代方案用于抗病毒药物的筛选与评价。主蛋白酶荧光底物的设计原理简单且巧妙：首先，将淬灭态的 RFP-A 1 与无荧光的 RFP-B 1 通过连接肽（ AVLQS ）连接形成异源二聚体。在完整状态下，二聚体将产生高强度红色荧光；当主蛋白酶切割连接肽后，二聚体解离，导致荧光值急剧降低。研究者利用荧光动力学法和电泳法的组合式实验即可快速筛选蛋白酶抑制剂（图1）。荧光底物水解法具有经济简便和灵敏可靠等优点，是 FRET 筛选方法的理想替代方案。此外，该模块化荧光底物设计策略也具有良好的普适性，仅通过替换“ 切割序列”，即可快速改造为通用型抗病毒药物高通量筛选平台。目前，荧光底物水解法已被应用于肠道病毒 3C 蛋白酶和基孔肯雅病毒 nsP2 蛋白酶抑制剂的高通量筛选，初步发现了 5 个具有优异抗病毒活性的新型先导化合物。