mRNA 技术自诞生之初就流淌着德国人的血液。在 mRNA 技术的商业化过程，有两家德国 mRNA 公司发挥了重要作用。一家是根植于德国著名大学城——图宾根的CureVac，另外一家是位于莱茵河畔美因茨的BioNtech。有时候，你很难不相信风水。BioNtech 总部所在的街道名 “An der Goldgrube” 意为“在金矿旁”，凭借着新冠 mRNA 疫苗 Comirnaty，BioNTech 确实在这里挖到了一座改变自己命运的大金山。CureVac 就没有那么好运了，虽然成立比 BioNtech 还要早八年，但是发展却一直很不顺，风风雨雨挣扎了二十六年后，反倒被后生 BioNtech 在去年六月份以 12.5 亿美金收入囊中。CureVac 的悄然落幕跟几乎偏执地押宝非修饰 mRNA 离不开关系。倒不是说，与修饰 mRNA 相比，非修饰 mRNA 就一无是处，只是机会来临的时候，一旦选错路线，在节奏上滞后，便会被挤出赛道。

本期内容，我们将回顾 CureVac 在非修饰 mRNA 技术上面的研发历程，深入思考如何根据应用场景在修饰与非修饰之间做出理智选择。

裸非修饰加帽 mRNA 在小鼠骨骼肌表达

众所周知，细胞是带负电的。在进化过程中，生物体似乎选择了一种负电环境。所有天然脂质要么是中性的，要么是带负电荷的。上世纪八十年代，德裔美国科学家Philip Felgner却想人工合成阳离子脂质（cationic lipids），将其嵌入至脂质体，从而与带负电荷的细胞膜融合，将药物递送至细胞中。当时市面上没有能形成脂质体（liposome）的阳离子脂质。与化学家沟通后，Philip Felgner 成功制备了带正电荷的阳离子脂质 DOTMA。

1987 年，Philip Felgner 将阳离子脂质 DOTMA/中性磷脂 DPOE 与带负电荷的 DNA 混合，形成了一种结构上完全不同于 liposome 的脂质-DNA 复合物(lipoplex)。liposome 是一种闭合的、含有水核的双层膜结构，而 lipoplex 是一种多层叠片状的实心复合体。携带正电荷的阳离子电脂质遇到负电 DNA 时，强烈的静电引力会产生一种“坍缩”效应，引力大到足以把 DNA 表面和脂质表面的水分子层全部“挤出去”。整个复合体内部几乎没有多余的空间容纳水分，DNA 与脂质膜高度压缩、紧密贴合。所以，lipoplex 在物理性质上表现为一个高密度的固体微粒，而不是含有液态核心的囊泡。细胞摄取 lipoplex 后，其包封的 DNA 发生逃逸，从而表达目的蛋白。Philip Felgner 将这种阳离子脂质介导的细胞转染方式命名为 Lipofectin[1]。

1989 年，在加利福尼亚圣地亚哥的索尔克生物研究所，Philip Felgner 结识小自己九岁的研究生Robert Malone。Robert Malone 是当时熟练掌握体外合成 mRNA 技术的少数人之一。两人展开合作，Philip Felgner 提供阳离子脂质，Robert Malone 负责合成 mRNA。他们采用 Lipofectin（DOTMA/DPOE）成功将体外合成的编码荧光素酶的非修饰 Luc mRNA 高效转染至人、大鼠、小鼠等的肿瘤细胞或者胚胎成纤维细胞中，并且，在不同类型的细胞中均可检测到荧光素酶的高效表达。此外，他们还发现携带β-globin 5'/3'UTR 序列的 Cap-Luc mRNA 要比缺乏这些元件的 Luc mRNA 表达水平高出至少 1000 倍[2]。

1990 年前后，Philip Felgner 在基因治疗先驱 Ted Friedman 实验室遇到了一个擅长做组织切片的博后John Wolff。随后，Philip Felgner、Robert Malone 及 John Wolff 直接将裸露的报告基因非修饰 mRNA（加帽加尾+非洲爪蟾 $\beta$-珠蛋白的 5'/3' UTR ）注射到小鼠活体内，注射部位为骨骼肌，无须任何递送载体。令人惊讶的是，在注射部位肌肉细胞中观察到显著的报告基因蛋白（荧光素酶、β-半乳糖苷酶及氯霉素乙酰转移酶）表达[3]。这项研究使得人们开始真正思考利用 mRNA 技术在体内表达抗原或者其他功能性蛋白，实现疾病的预防或者治疗。

非修饰 mRNA 触发 CTL 免疫反应

由于 mRNA 极度不稳定，上世纪 90 年代至本世纪初，绝大多数研究者并不看好 mRNA 技术的临床转化应用。然而，CureVac 创始人 Ingmar Hoerr却是个例外。1999 年，正在德国图宾根大学攻读博士学位的 Ingmar Hoerr制备编码 β-半乳糖苷酶的非修饰报告基因β-gal mRNA（加帽加尾+非洲爪蟾 $\beta$-珠蛋白的 5'/3' UTR ），将其注射至小鼠体内。无论是静脉/皮下注射阳离子脂质体包封的鱼精蛋白/β-gal mRNA（30μg），还是耳廓内注射鱼精蛋白/β-gal mRNA (1μg/30μg)，抑或是耳廓内直接注射毫无保护的“裸奔”β-gal mRNA（30μg），均能在小鼠体内成功诱导明显的β-半乳糖苷酶特异性的细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）反应及 IgG 抗体[4]。 Ingmar Hoerr 还发现采用肌肉/皮下/静脉注射鱼精蛋白/β-gal mRNA（30μg）均无法触发 CTL 反应，表明接种位点会影响非修饰 mRNA 是否能够成功触发免疫反应。总之，这项研究使得 Ingmar Hoerr 敏锐地意识到 mRNA 技术在治疗肿瘤方面蕴藏的巨大潜力。

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2000 年，Ingmar Hoerr 博士毕业， 随即创立 CureVac，聚焦基于 mRNA 技术的癌症治疗。彼时，在美国宾州大学，后来的诺奖得主 Karikó与 Drew Weissman 还在寻找外源合成 mRNA 触发免疫原性的原因。尽管 Ingmar Hoerr 的博士论文已确证在活体组织直接注射未修饰 mRNA 即可表达产生蛋白，但是，彼时的投资者仍然满腹狐疑，他们只知道 mRNA 极度不稳定，毫无用处。Ingmar Hoerr 跟很多专业投资者聊过，他们全部态度傲慢地说：“抱歉，年轻人，我不相信你，这玩意儿就是垃圾。”当时， Ingmar Hoerr 是个毕业没多久的年轻小伙子，没人认识他，大家也不相信像图宾根这样的小镇上有人能将 mRNA 做到他所宣称的那样。

通过序列优化降低非修饰 mRNA 免疫原性

不同于 Karikó 坚持的碱基修饰路线降低外源合成 mRNA 免疫原性， Ingmar Hoerr 一开始便选择了非修饰（unmodified）mRNA 作为 CureVac 的核心技术，试图通过复杂的序列优化来增强 mRNA 稳定性并降低免疫原性，具体的方法集中在两个专利中：WO/2002/098443 和 WO/2012/19780[8,9]。

专利 WO/2002/098443 主张 mRNA 序列优化朝着两个方向：第一，在不改变 mRNA 编码氨基酸序列情况下，提升 GC 含量，增强 mRNA 稳定性。与原始 mRNA CDS 序列相比，经过优化后的 mRNA CDS 序列中 G/C 含量至少提高 7 个百分点，更优选至少提高 15 个百分点，更优选至少提高 20 个百分点。第二，在提升 mRNA 序列稳定性的同时，还需要考虑翻译效率，将序列中的稀有密码子替换为宿主细胞中的常见密码子。此外，专利还描述了 mRNA 以下一种或者几种特征：5'帽结构、 poly(A)尾巴、5'/3' UTR 序列及去除序列中不稳定元件。

几乎所有真核生物 3'末端均有一个 poly(A)尾巴，长度 200-250。 poly(A)尾巴与 mRNA 稳定性、翻译及出核密切相关。 poly(A)结合蛋白(PABP)与真核起始因子复合体 eIF4F 的组成之一 eIF4G 相互作用，使得poly(A)序列通过增加 40S 亚基向 mRNA 的招募来刺激翻译。在翻译起始阶段，mRNA 的帽子结构与 poly(A)尾巴形成一个闭环结构。有趣的是，依赖 DNA 复制合成的组蛋白 mRNA 在 3'末端却不存在 poly(A)尾巴，而是以茎环结构结束。有研究人员发现与poly(A)尾巴，组蛋白茎环结构也能构增强 mRNA 翻译。在专利 WO/2012/19780 中，CureVac 研发人员发现在 mRNA 序列 3'末端引入组蛋白茎环+poly(A)序列（不受前后顺序影响），两者可协同提升蛋白表达水平。

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首个 mRNA 疫苗人体临床试验—非修饰狂犬病毒 mRNA 疫苗

2013 年，CureVac 启动首个狂犬病毒 mRNA 疫苗 CV7201 的 I 期临床试验，这也是全球首个 mRNA 疫苗的人体临床试验。CV7201 是一种冻干 mRNA 疫苗，编码抗原是狂犬病毒糖蛋白(RABV-G)，使用的是基于序列优化的非修饰 mRNA，以鱼精蛋白作为递送载体。受试者接种 3 剂 CV7201，接种剂量范围为80-640μg，接种方式为针头注射(needle-syring)或者无针装置(needle-free devices)。从结果来看，CV7201 安全性和耐受性良好。有趣的是，采用无针装置进行皮内或者肌内免疫接种后，均可诱导产生符合 WHO 标准的狂犬病中和抗体反应，然而，使用注射器注射则无法实现此效果[5]。

由于 CV7201 触发的免疫反应取决于给药途径，需要使用专门的注射设备。为实现更好的免疫效果，CureVac 将递送系统从鱼精蛋白替换为脂质纳米颗粒 LNP，制备了一种新型狂犬病毒 mRNA 疫苗 CV7202，并且，在 2018 年启动 I 期临床试验。2021 年，CureVac 公布 CV7202 I 期临床试验结果：两剂 1 μg 或 2 μg 的 CV7202 耐受性良好，所有受试者均产生了符合 WHO 标准的狂犬病中和抗体反应，但 5 μg 剂量首次接种便产生了不可接受的高反应原性[6,7]。

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非修饰新冠 mRNA 疫苗惨败

CureVac 设计的一款新冠非修饰 mRNA 疫苗 CVnCoV，从序列结构上看，5'端存在 cleanCap 帽类似物，编码 Spike 蛋白的高 GC CDS 区域，alpha-haemoglobin 3'UTR（人α-血红蛋白基因）， poly(A)64+ poly(C)30 及组蛋白茎环结构。CVnCoV 以 LNP 作为递送系统，由奥地利知名脂质体 CDMO 公司 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH 负责生产。

2020年6月，CureVac 启动CVnCoV I 期临床试验中，接种两次，间隔 28 天。结果显示，接种 2 剂 CVnCoV（2-12μg 剂量范围内）是安全的，反应原性可接受，并且，12 μg 剂量引发的免疫反应水平(中和抗体与 IgG 血清抗体)能达到新冠康复者血清中观察到的水平[10]。

2020 年 12 月，CureVac 启动 CVnCoV 2b/3 期临床试验，参与者为 36,500 人。由于 I 期临床试验中 CVnCoV 的反应原性和免疫原性呈现剂量依赖性增加，在权衡高免疫原性和耐受性后，CureVac选择 12 μg 作为接种剂量[11]。2021 年 6 月 16 日，CureVac 表示 CVnCoV 在 IIb/III 期试验中仅仅显示出 48.2%的保护效率，这一数值远低于同期 mRNA-1273 的 94%保护效率与 BNT162b2 的 95%保护效率。CureVac 匆忙叫停 CVnCoV 项目的开发，转而启动下一代新冠 mRNA 疫苗 CV2CoV 的开发。

与 CureVac 第一代新冠非修饰 mRNA 疫苗相比，CV2CoV 在非编码区域做了较大优化，序列 5'端到 3'末端的结构依次有：cleanCap 帽类似物，编码 Spike 蛋白的高 GC CDS 区域，HSD17B4 5′UTR（源自人羟类固醇 17-β脱氢酶 4 基因），编码 Spike 蛋白的高 GC CDS 区域，PSMB3 3'UTR（源自人类蛋白酶体 20S 亚基β3 基因），组蛋白茎环及 Poly(A)100。加拿大 Acuitas Therapeutics 负责生产包封 CV2CoV mRNA 的 LNP 递送系统。非编码区优化后的 CV2CoV 非人灵长类动物中免疫原性和保护效率均得到显著提升。值得一提的是，研究人员用 12μg CV2CoV 两次免疫食蟹猴触发的针对新冠原始毒株的假病毒中和抗体滴度可达到用 30μg BNT162b2 两次免疫的水平。2024 年 7 月 3 日，CureVac 与 GSK 重组合作协议。GSK 支付了 4 亿欧元首付款（总价高达 14.5 亿欧元），拿走了包括 CV2CoV 在内的所有新冠及流感项目的全球权益。CreVac 在新冠 mRNA 疫苗项目上的重金投入，不仅落得惨败收场，而且动摇了自身稳定运营的根基。

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非修饰 mRNA 胶质母细胞瘤疫苗—CVGBM

胶质母细胞瘤（GBM）是一种具有侵袭性的脑肿瘤，预后不佳且复发率高，临床治疗选择有限。CureVac 开发了一款基于非修饰 mRNA 的胶质母细胞瘤 mRNA 疫苗 CVGBM，编码 8 个 TAA 抗原，分别为 5 个 Class 1 表位（MHC I 类）和 3 个 Class 2 表位（MHC II 类）。在 CVGBM I 期临床试验中，招募新诊断 MGMT 未甲基胶质母细胞瘤患者，接种剂量为 12μg/25μg/50μg/100μg，受试者将在第 1、8、15、29、43、57 和 71 天共接受 7 次 CVGBM 注射。2024 年底公布的初步试验结果显示，CVGBM 在 100μg剂量范围内通常耐受良好，根据所有队列的安全数据，100μg 被选为试验扩展的推荐剂量[13]。

修饰还是不修饰，这是一个值得思考的问题。

头对头比较修饰与非修饰 mRNA 触发的免疫反应

在最近的一项头对头研究中，恒河猴每隔 2 周免疫五次，第 27 周再免疫一次，使用编码相同抗原的 HIV-1 Gag mRNA 疫苗，根据碱基类型，分为两种：序列优化、未修饰的 mRNA（160 μg）和 m1Ψ修饰 mRNA （400 或 800 μg）。含有未修饰尿苷的 mRNA 疫苗诱导较高的 IFNα和 IL-7 水平，而 m1Ψ修饰 mRNA 则刺激更强的 IL-6 和 TNF 。此外，未修饰的 mRNA 在第五次注射后诱导的细胞因子水平低于第一剂（蓝色框），表明免疫耐受诱导;而 m1Ψ修饰的 mRNA 细胞因子反应在第一至第五次注射间相似（绿色框）。尽管先天反应不同，但两种 mRNA 疫苗的抗体滴度和记忆 T 细胞反应相似（中间）[14,15]。

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IFNα诱导的差异并不令人意外，因为未修饰 mRNA 应在浆细胞样树突状细胞（pDC）中激活 TLR7，在单核细胞中激活 TLR8，在多种类型细胞中更强烈激活 RIG-I 样受体（RLR），这些受体均能诱导 I 型 IFN 释放。相比之下，IL-7 诱导的机制似乎不那么明确。虽然 IL-7 通常被认为是淋巴器官中持续表达的细胞因子，但其表达可通过肝脏中的 TLR 激活诱导。这可能发生在高剂量未修饰 mRNA 给药后，尽管这一直接效应尚未被证实。尽管如此，无论其来源如何，IL-7 通常被认为是支持并有益于细胞毒性反应的 T 细胞。相比之下，m1Ψ-mRNA 的应用则导致 IL-6 和肿瘤坏死因子（TNF）释放增加。这不太可能是 RNA 修饰本身诱导的结果。注射用到的 m1Ψ-mRNA 剂量越高，伴随的是更多的 LNP，而 LNP 本身已被证明能诱导 TNF 和 IL-6。

研究者还观察到，未修饰 RNA 在重复注射接种时表现出耐受效应，第五次注射接种未修饰 RNA 时，基因的差异调控（DEGs）比第一次更少，且 IFNα、IL-7 和 IL-7 下游靶点的表达也降低。有趣的是，低剂量 m1Ψ-mRNA 给药时 DEGs 也降低，但 IL-6 水平总体保持不变，且高剂量 m1Ψ-mRNA 中任何检测数值均无显示出耐受性。这些差异可能源于未修饰 mRNA 的 TLR 活性差异，因为 TLR3/7 /8 的激活已被报道能诱导先天免疫耐受。

BioNTech 如何使用修饰与非修饰 mRNA

上面我们系统性回顾了 CureVac 的研发历程，直到被收购前，CureVac 仍然在坚持开发基于非修饰 mRNA 的肿瘤疫苗。我们查看了 BioNTech 公司网站上关于 mRNA 技术平台的介绍，发现他们根据不同的应用场景来决定使用修饰 mRNA 还是非修饰 mRNA。

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FixVac 平台与 iNEST 平台使用的是非修饰 umRNA。FixVac 平台开发的是由固定组合的编码非突变肿瘤抗原（在特定癌症类型中经常表达）的 mRNA 构成，管线涉及黑色素瘤（BNT111）、HPV16+头颈癌(BNT113)、非小细胞肺癌(BNT116) 。iNEST 是个性化肿瘤 mRNA 疫苗开发平台，旨在针对患者特定癌症特有的突变，即所谓的肿瘤新抗原(tumor neoantigens)，管线涉及结直肠癌（NCT04486378）、高风险肌肉浸润性尿路上皮癌（NCT06534983）及胰腺癌（NCT05968326）。

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传染病疫苗与细胞因子项目使用的修饰 modmRNA。传染疫苗涉及管线主要包括：新冠 mRNA 疫苗 BNT162b2，新冠流感组合疫苗 BNT162b2+BNT161，结核疫苗 BNT164，单纯疱疹病毒疫苗 BNT163，猴痘疫苗 BNT166K 及 HIV 疫苗 BNT168。细胞因子是小型蛋白质，在调控对病原体和癌细胞的免疫反应中发挥重要作用。重组细胞因子目前被用于治疗多种传染病和癌症适应症，但其疗效因半衰期短且应用到人体后生物利用度低而受限。BioNTech 旨在开发编码细胞因子的修饰 mRNA，以减少不良免疫反应并延长蛋白质生成时间，增强抗肿瘤免疫。

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小结

M1Ψ既能减弱 mRNA 诱导的多种先天免疫受体激活，也能增强 mRNA 翻译。m1Ψ的使用也被认为是 mRNA-1273 和 BNT162b2 疫苗成功的关键，这两款疫苗在预防新冠感染方面均超过 90%， 而未修饰的 CVnCoV mRNA 疫苗仅有 48%的保护效率，尽管其采用了与 BNT162b2 相同的脂质纳米颗粒（LNP）配方。后续优化版本 CV2CoV 在临床前 NHP 模型中表现出与 BNT162b2 类似的免疫反应，但截至 2025 年 7 月，临床数据仍在等待。尽管如此，CureVac 后来其流感和新冠疫苗中也开始转向使用 m1Ψ，包括 CV0501、CV0601 和 CV0701。我们不由产生疑问：除了更低的剂量，难道非修饰 mRNA 真的没有任何优势吗？BioNTech 显然并不这么认为，一方面大手笔收购 CureVac，另一方面在肿瘤疫苗开发中广泛使用非修饰 mRNA。未来可能需要更多的研究对非修饰与修饰 mRNA 疫苗做头对头比较，以探索不同场景下两种不同碱基修饰 mRNA 的优势到底有何种差异性。

参考文献:

  1. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.

  2. Cationic liposome-mediated RNA transfection.

  3. Direct Gene Transfer into Mouse Muscle in Vivo.

  4. In vivo application of RNA leads to induction of specific cytotoxic T lymphocytes and antibodies

  5. Safety and immunogenicity of a mRNA rabies vaccine in healthy adults: an open-label, non-randomised, prospective, first-in-human phase 1 clinical trial

  6. Development of mRNA rabies vaccines

  7. Proof-of-concept of a low-dose unmodified mRNA-based rabies vaccine formulated with lipid nanoparticles in human volunteers: A phase 1 trial

  8. WO2012019780 - 包含或编码组蛋白茎环和聚腺苷酸序列或用于增加编码蛋白表达的聚腺苷酸化信号的核酸

  9. WO2002098443 - 具有更高 G/C 含量和优化密码子的稳定 mRNA，用于基因治疗

  10. Safety and immunogenicity of an mRNA-lipid nanoparticle vaccine candidate against SARS-CoV-2 : A phase 1 randomized clinical trial

  11. Efficacy and safety of the CVnCoV SARS-CoV-2 mRNA vaccine candidate in ten countries in Europe and Latin America (HERALD): a randomised, observer-blinded, placebo-controlled, phase 2b/3 trial

  12. Optimization of non-coding regions for a non-modified mRNA COVID-19 vaccine

  13. Preliminary immunogenicity results from the dose escalation phase of a first-in-human study of the mRNA-based cancer vaccine CVGBM in patients with newly diagnosed MGMT-unmethylated glioblastoma

  14. Immunogenicity and innate immunity to high-dose and repeated vaccination of modified mRNA versus unmodified mRNA.

  15. To modify or not to modify—That is still the question for some mRNA applications.

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