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蛋白质翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）决定了蛋白质在细胞中的真实功能状态，其中以糖基化与磷酸化最具系统调控意义。然而，在实际蛋白组学研究中，由于样本拆分、并行处理、分别富集，再在计算层面勉强拼接，这些信息长期被迫分散在不同实验流程中获取。
这种策略在方法学上并非优雅的选择，而是一种历史妥协——它带来的问题并不隐蔽：样本损耗成倍放大、流程时间冗长、批次效应叠加、定量一致性被结构性削弱。
来自中国科学院、重庆医科大、南昌赣江中药创新中心等研究团队提出并系统验证了一种顺序式多 PTM 蛋白组学平台MuPPE（Multiplexed PTM Proteomics by Protein Aggregation）。其核心思想是在单一样本、单一反应体系中，依次完成蛋白组、糖基化蛋白组与磷酸化蛋白组的捕获与解析，从根本上重构多 PTM 蛋白组学的工程逻辑。
相关研究内容以「A versatile platform for sequential glyco-, phospho-, and proteomics with multi-PTMs integration」为题，于 2026 年 1 月 28 日发布在《Nature Communications》。
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-68270-7
蛋白聚集驱动的顺序式富集
传统多 PTM 蛋白组学流程的核心假设，是不同修饰类型需要彼此独立的富集化学环境与处理条件。因此，研究者通常在样本裂解后即进行拆分，每一份样本对应一种 PTM 富集策略。
这一做法在概念上简单，却在工程上代价高昂。首先，样本拆分会直接降低每一分支的起始物质量，使得低丰度修饰位点更易丢失；其次，不同富集流程之间不可避免地产生处理偏差，最终反映为定量噪声的系统性放大；更关键的是，这种并行流程天然不适用于样本量受限的场景，如临床体液或稀有组织。
研究团队在论文中明确指出，问题并不在于富集材料或质谱灵敏度的不足，而在于流程结构本身并不为「多层信息一致性」服务。MuPPE 正是在这一判断基础上被提出，其目标不是增加某一 PTM 的覆盖率，而是在同一物理样本轨迹中，最大限度保留不同修饰层之间的真实对应关系。
图 1：MuPPE 平台实现了集成的多层次蛋白质组学，提升了效率和覆盖范围。
MuPPE 平台是一个整合蛋白质聚集捕获（PAC）、珠上消化和序列 PTM 富集的统一流程。作为原理验证，该平台使蛋白质组、糖蛋白组和磷蛋白组同时被探测成为可能。它从蛋白质变性、还原和烷基化开始，引入一种经过修改且可扩展的 PAC 方法，实现高效的蛋白质分离。
随后，研究者通过精心设计的顺序洗脱与酶解策略，使不同修饰层在同一载体上被依次释放并分析。整个过程中，样本始终处于单管、单体系中完成，没有发生任何物理拆分。这种顺序式设计的直接结果，是样本损耗被系统性压缩，同时不同修饰层之间的相对定量关系得以最大程度保留。
效率、一致性与覆盖度的系统评估
在方法学评估中，研究团队首先对 MuPPE 与传统并行富集流程进行了直接对比。在处理时间上，MuPPE 将完整多 PTM 分析流程压缩至约 4 小时，相较传统方法动辄 24–36 小时的处理周期，时间成本降低约 87.5%。这一压缩并非通过减少步骤实现，而是通过消除并行流程中的冗余处理完成。
在定量一致性方面，MuPPE 在多个生物重复实验中表现出显著更低的变异系数。无论是蛋白组、糖基化蛋白组还是磷酸化蛋白组，变异系数（CV%）均稳定维持在约 12–15% 区间（平均 CV = 12.3%，而溶液中消化为 17.6%），而传统并行方法在相同条件下普遍超过 20%。
图 2：使用 MuPPE 对糖蛋白组、磷酸蛋白组和蛋白质组进行序列化分析。
覆盖度分析显示，MuPPE 在不牺牲深度的前提下，实现了对三类分子层级的稳定检测。数千个蛋白、上万条糖基化与磷酸化位点在单次实验中被同时解析，且不同修饰层之间的对应关系清晰可追溯。这一点在后续的生物学应用中尤为关键。
图 3：小鼠衰老队列的磷蛋白组、糖蛋白组和蛋白质组整合分析。
应用层面，MuPPE 适用于多种复杂生物样本，包括血清、脑组织以及脑脊液等低起始量或高复杂度体系。该平台在样本量受限条件下依然保持稳定的检测能力，且不同 PTM 层的信号强度与定量分布高度一致。
值得注意的是，论文并未刻意放大某一具体生物学发现，而是将重点放在方法本身在真实样本条件下的稳健性验证。这种克制的呈现方式，反而凸显了 MuPPE 作为平台级工具的通用潜力。
针对流程结构的蛋白组学重构
MuPPE 首次实现了单一样本中糖基化、磷酸化与总蛋白的串联分析，解决了传统方法样本需求量大、修饰间关联性难以捕捉的痛点。其在低样本量、高复杂性样本中表现出优异的富集效率和重现性，拓展了未注释 PTM 位点的发现。
该平台目前对单细胞水平的低蛋白样本仍需进一步优化，但不妨碍它在效率、一致性与样本利用率之间实现了难得的平衡。对于需要在有限样本中同时解析多层蛋白修饰信息的研究场景而言，这种工程层面的改变，可能比单一指标的提升更具长期影响。
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