Cell | 三步锁定：揭秘囊泡拴系的连续结构动力学|三步锁定|动力学|囊泡|复合体|细胞膜|质膜|连续结构

撰文丨易

组成型分泌是维持细胞膜稳态、细胞生长与分裂的核心过程，其核心步骤是分泌囊泡与靶细胞膜的特异性对接，即“拴系 ”。在这一过程中，外囊复合体作为高度保守的异源八聚体蛋白复合物，是囊泡拴系的主要分子机器。尽管已知单个囊泡的拴系需要多个外囊复合体协同工作，但这些多拷贝外囊复合体如何组织成一个动态的、具有更高阶结构的功能单元 —— 即外囊复合体高阶结构，其时空组织形式与功能机制在生理条件下仍是一个未解之谜。传统体外研究已解析了单个外囊复合体的原子结构及其与部分伙伴蛋白（如Sec4、Sec9）的相互作用位点，但无法重构细胞内多拷贝复合体协同工作的动态高阶机制。这种机制的研究面临着巨大挑战，因为分泌事件具有高度极化、瞬时发生且定位局域化的特性。因此，阐明外囊复合体高阶结构的动态构象全景图，并对其不同构象进行功能注释，对于从分子层面完整理解分泌过程至关重要，这不仅关乎基础细胞生物学，也因其在自噬、病原体侵染等众多通路中的核心作用而具有广泛的生物医学意义。

近日，西班牙巴塞罗那庞培法布拉大学Oriol Gallego、加泰罗尼亚中央大学-维克大学Carlo Manzo、巴斯克大学Daniel Castano-Diez和欧洲分子生物学实验室Jonas Ries联合在Cell期刊上发表题为Continuum architecture dynamics of vesicle tethering in exocytosis的研究论文，通过整合多种成像技术，揭示了分泌囊泡在胞吐过程中被一个由7个外囊复合体组成的动态环形高阶结构分步拉向细胞膜，并最终在Sec18介导下解离该结构以回收利用的完整动态过程。

研究团队采用了一种创新的多模态成像集成策略，在模式生物酿酒酵母中，对分泌过程中的蛋白质与膜结构进行了时间分辨的原位解析。首先，利用聚焦离子束扫描电镜和冷冻电子断层扫描技术，对近细胞膜囊泡进行了三维成像和统计分析，获得了囊泡的平均半径与分布信息。为确定参与单个拴系事件的外囊复合体拷贝数，采用了活细胞荧光强度比率测定法。随后，结合上述结构数据，建立了计算模型，以探索多个外囊复合体在拴系囊泡时可能采取的构象空间（分散片状或均一环状）。研究发现，平均有7个外囊复合体共同形成一个柔性的环状高阶结构，其半径可动态变化，以拴系距离质膜45纳米以内的囊泡。该环状结构并非静态，而是在分泌过程中经历连续的径向扩张。

通过整合超分辨率成像与时间标记蛋白的定位信息，发现外囊复合体集群在分泌早期（与Sec2共定位时）呈现较为紧凑的构象，而在后期（与Sec9共定位时）则扩展为半径更大的稳定环状结构。

动力学模型表明，该环状结构的半径从起始的平均约19纳米，以指数形式扩张，最终在囊泡融合前稳定在平均约38纳米的半径。冷冻电镜结构分析进一步揭示了囊泡被拉向质膜的过程并非连续平滑，而是经历了三个距离明确的亚稳态：分别位于质膜外约27纳米、18纳米和5纳米处，表明拴系是一个分步进行的机制。

此外，研究揭示了AAA ATP酶Sec18的新功能。它不仅如已知那样解离融合后的SNARE复合体，还直接或间接地与Exo84亚基发生近距离相互作用，负责在囊泡融合后（即外囊复合体集群生命周期的最后约300毫秒内）解离稳定在质膜上的、半径为38纳米的静止态外囊复合体高阶结构。通过部分剔除Sec18的功能实验证明，该解离过程是回收外囊复合体、进而控制新分泌事件起始速率的关键限速步骤，而非SNARE复合体的回收。