大曲是白酒发酵的核心驱动力，主要以小麦、大麦或豌豆为原料，在开放环境下富集微生物自然发酵而成，其质量与白酒的品质密切相关。其中，高温大曲不仅是酱香型白酒酿造的核心功能菌剂，同时作为风味调控组分参与多香型白酒的发酵过程，在大曲中占据重要地位。
目前研究表明，基于可培养微生物分离技术结合代谢组学分析，可定向选育高产酶或特征风味合成的功能菌株，通过内源性菌株回添实现微生态定向调控。
贵州大学酿酒与食品工程学院的王念、黄永光*，贵州大学资源与环境工程学院的龚佳欣等以在高温大曲中普遍存在且具备优良酿造性能的内源性菌株为基础，构建合成菌群进行固态模拟发酵，应用顶空固相微萃取（HS-SPME）与气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术对不同温度胁迫下合成菌群挥发性化合物进行表征。采用宏转录组学技术揭示温度胁迫下合成菌群关键基因表达差异以及风味代谢机制，以期为合成微生物群落构建以及发酵工艺的优化提供理论指导。
1 酿造功能菌株发酵特性分析
为探究
B. licheniformis
S. fibuligera
T. crustaceus的发酵特性，采用HS-SPME-GC-MS技术对产香菌株
B. licheniformis
S. fibuligera固态模拟发酵样品代谢轮廓进行解析，通过酶比活力表征高丰度优势菌株
T. crustaceus的酶学性质，结果如图1所示。从
B. licheniformis固态模拟发酵样品中检出的种类数量显著高于之前研究检出的挥发性化合物数量。共检出63 种主要挥发性化合物，包括芳香族类11 种、醛酮类11 种、酯类11 种、醇类8 种、酸类7 种、酸类7 种、烷烃类4 种、吡嗪类2 种、酚类1 种和呋喃类1 种。从
S. fibuligera固态模拟发酵样品中检出70 种主要挥发性化合物，包括酯类24 种、醇类16 种、芳香族类8 种、酸类6 种、烷烃类6 种、醛酮类4 种、酚类3 种、醚类2 种和其他类1 种。
T. crustaceus的纤维素酶、酸性蛋白酶、-淀粉酶、阿魏酸酯酶比活力分别为3 394.73、47.72、6 438.87、4.79（nmol·g）/min，展现出良好的原料降解能力。模拟发酵结果表明
B. licheniformis
S. fibuligera都具备多途径代谢活性，能够合成丰富的挥发性化合物，但
S. fibuligera具有更好的环境适应性以及更突出的产酯能力 。
2 不同温度胁迫诱导合成菌群发酵关键风味代谢物分析
基于偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型对不同温度条件下合成菌群风味谱差异进行解析。由图2a可知，模型参数
R2 ＝0.995、
Q2 ＝0.984，证实模型具有优良的稳定性和预测效能。3 组样品呈现明显的组间分离与组内聚集特征，该空间分布特征与挥发性化合物组成差异显著相关，表明不同温度胁迫对合成菌群的代谢网络动态具有显著影响。在混菌发酵体系中，共检出107 种挥发性化合物，其中醇类（28 种）、醛酮类（15 种）、芳香族类（11 种）、酸类（5 种）、酯类（29 种）、烷烃类（5 种）、酚类（7 种）、吡嗪类（4 种）、醚类（1 种）及其他类（2 种）。由图2b可知，T30组挥发性化合物总质量浓度为（16.17±0.99）mg/L，T40组表现出最佳的代谢物积累能力，其挥发性化合物总质量浓度达到（20.06±0.97）mg/L，而T50组挥发性化合物总质量浓度只有（7.04±0.77）mg/L。发酵样品中主要挥发性化合物总量随温度升高呈先升后降趋势，其中吡嗪类、芳香族类、酚类、酸类及酯类物质含量均呈现相似波动规律，而醇类与醛酮类物质含量随温度升高持续降低，醚类及烷烃类仅在T30和T50组被检出（图2c）。在物质多样性方面，T30组中检测到62 种挥发性化合物，T40组和T50组分别为75 种与58 种（图2c），进一步证实T40组在挥发性化合物多样性方面具有最优代谢表现。在组合发酵中检测到的吡嗪类物质含量显著高于单菌发酵，反映出微生物群落的复杂性及其代谢协同效应有助于吡嗪类物质积累，表明发酵温度对合成菌群的代谢产物合成能力具有显著调控作用 。
以差异倍数（FC）≥2或FC≤0.5、
P＜0.05以及变量投影重要性（VIP）＞1为条件筛选差异代谢物（图3）。与T30组相比，T40组有6 种挥发性化合物显著上调，分别是异丁酸乙酯、3-辛醇、2-十六醇、愈创木酚、3-乙酰氧基丁烷和苯乙醇。说明40 ℃可能激活了苯丙氨酸代谢途径促进苯乙醇的生成，同时促进以愈创木酚为代表的酚类与以2-十六醇为代表的长链醇类生成。在T30与T50比较组中，7 种挥发性化合物下调（2-甲氧基-4-乙烯苯酚、4-羟基苯乙烯、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、油酸苄酯、异戊醇和2,3-丁二醇）。与T40组相比，高温对T50组代谢物的生成表现出明显的抑制作用，包括苯乙醇、异丁酸乙酯、2-甲氧基-四甲基苯酚、2,3-丁二醇、1-辛烯-3-醇、四甲基吡嗪、甲酸庚酯、异戊醇和2-十六醇在内的9 种挥发性化合物显著下调，只有1-甲基丙烯酸十一酯上调。对这些差异代谢物进行统计，共有16 种重点代谢物。T50组代谢物减少，说明50 ℃对风味物质积累具有显著负面影响，这可能与高温抑制
S. fibuligera的生长甚至使其失活有关，在50 ℃时其无法与其他2 种微生物协同作用促进多种物质的生成 。
3 不同温度胁迫诱导合成菌群代谢通路注释
在不同温度微生物模拟发酵样品及其平行样转录组学数据的基础上，本研究从基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库对各样品的代谢功能相似性进行PCA。如图4所示，不同温度下模拟发酵样品中合成菌群的代谢表达存在异同。其中在30 ℃和40 ℃条件下模拟发酵样品的距离相对接近，而在50 ℃条件下进行模拟发酵的样品与其他2 组样品距离较远。这表明合成菌群在30 ℃和40 ℃环境中的代谢通路较为相似。而在50 ℃环境中合成菌群的代谢通路产生了明显的变化。
为进一步明确温度梯度下合成菌群的代谢功能特征，本研究对合成菌群表达的基因进行KEGG数据库的功能进行注释分析，结果如图5a所示。KEGG一级代谢通路表明，合成菌群主要以新陈代谢、遗传信息处理、细胞过程3 类代谢为主，共表达丰度占90%以上。合成菌群的KEGG二级代谢通路主要包括碳水化合物代谢、能量代谢、氨基酸代谢通路，它们共表达量可占据80%以上，这表明合成菌群在初级代谢特别是自身繁殖方面以及大分子物质降解方面表达出强烈的功能特征。如图5b所示，在50 ℃温度胁迫发酵下，合成菌群在氨基酸代谢途径上显著上调1.36～2.33 倍，在环境适应性途径上显著上调2.93～5.14 倍，在细胞活动途径上显著上调1.35～2.33 倍；相反，此温度下合成菌群的能量代谢功能表达下调57%～74%。氨基酸代谢途径活跃可能与
Thermoascus
Bacillus的协同作用有关。氨基酸代谢可支持应激蛋白合成和渗透调节，而脂质和能量代谢可以节省资源并避免代谢负担。结果说明在温度胁迫下，合成菌群通过“保核心功能，弃冗余消耗”的策略重新分配代谢资源 。
4 不同温度胁迫诱导合成菌群基因差异化表达
图6展示了不同温度胁迫发酵下基于KEGG数据库的合成菌群基因表达差异。不同温度对氨基酸代谢、能量代谢的表达具有影响。在30 ℃条件下，合成菌群主要高表达基因为K00004（
BDH）、K00655（
PlsC）、K03621（
plsX）、K05338（
lrgA）、K04047（
dps）等。其中，
BDH
PlsC是参与代谢的相关基因，其高表达通常与能量需求增加或脂质合成活跃相关；
plsX
lrgA
dps等基因的表达水平在热应激下上调，以维持细胞稳态；K13628（
iscA）的高表达在细胞能量代谢、电子传递、底物结合与激活、铁/硫存储、酶促反应等诸多过程中具有关键作用。K16509（
spxA）是
Spx家族的一个成员，常见于
Bacillus
Spx是一种激活因子，能够激活必要的反应以逆转氧化损伤的影响；同时也是一种负调控因子，通过推迟发育程序和耗能的生长相关功能协调能量分配，以应对应激。在30 ℃条件下，菌群间协同效应较弱，风味代谢活性未显著激活，整体呈现基础代谢状态。在40 ℃条件下，主要高表达基因包括K13727（
pdc）、K01903（
sucC）、K00260（
gudB）、K01664（
pabA）等。
pdc可催化丙酮酸生成CO 2 和乙醛，乙醛可通过羟醛缩合反应生成大分子的醛，随后经还原反应生成醇，这也解释了合成菌群在40 ℃条件下辛醇产量更高的原因（图3）。
sucC是柠檬酸循环中的关键酶，负责将琥珀酸转化为琥珀酰辅酶A，对能量代谢和细胞呼吸至关重要。
gudB是芽孢杆菌参与编码谷氨酸脱氢酶的基因。先前研究表明，大肠杆菌中的
pabA可调控氨基苯甲酸，用于合成叶酸（VB 9 ）。在合成菌群中亦检测到该基因，提示其可能具备相似的调控功能潜力。在40 ℃发酵条件下，合成菌群基因组的协同作用更为显著，其核心功能基因表达谱呈现显著转变，其中调控风味物质前体合成的相关基因表达显著上调。该现象与T40组中合成菌群风味代谢产物多样性最高的检测结果相印证，从而阐明40 ℃条件下合成菌群呈现最丰富风味代谢谱的分子机制。在50 ℃的高温发酵条件下，合成菌群的K00927（
dapD）、K01803（
ilvD）、K00939（
pgm）、K02948（
tpiA）、K02968（
gapA）、K02950（
eno）和K01689（
rpe）等基因呈现爆发式表达。
dapD
ilvD是参与赖氨酸与支链氨基酸合成途径的酶。前人的研究表明，中高温大曲氨基酸的差异可能与
Thermoascus
Bacillus等微生物丰度有关。在本研究中，
dapD
ilvD基因在高温组中的高丰度表达也验证了该结论。
pgm
tpiA
gapA
eno
rpe主要参与糖酵解和能量代谢途径。在高温胁迫下，合成菌群启动热应激响应机制，其代谢活性急剧上调但发生功能重定向，此类基因的高表达主要是通过能量供应强化、氧化还原平衡、代谢网络重构以适应高温胁迫 。
5 不同温度胁迫合成菌群中相关风味基因的转录调控特征
以主要差异挥发性化合物为导向，绘制相关风味基因表达的代谢通路（图7）。苯丙氨酸代谢是酱香型白酒风味形成的核心生化代谢途径之一，可产生苯乙醛、苯乙醇等多种芳香族类化合物，该类化合物主要具有玫瑰香气，对塑造酒体的典型香气特征具有重要意义。由图7可知，在苯丙氨酸代谢通路中，T50组的乙醇脱氢酶基因（
ADH5）相较于T30组和T40组显著上调，但由于底物（苯乙醛）匮乏，导致其苯乙醇含量显著降低。2,3-丁二醇、四甲基吡嗪的含量随温度变化显著波动，但相关基因的表达水平未发生同步响应，表明温度可能通过非转录调控途径（如底物可利用性、辅因子供应）驱动代谢物合成。苏氨酸代谢途径是2,3,5-三甲基吡嗪的主要生物合成途径。苏氨酸脱氢酶基因（
TDH）显著下调，在该途径中其他酶作用不明显的前提下，显著影响了发酵后期2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪的积累。此外，多数下调的差异代谢物，如异戊醇、异戊酸乙酯等，其生成途径的调控基因呈显著上调，造成这种不对应关系的原因可能基因表达调控是代谢物动态变化的先导因素。引起挥发性化合物差异的通路中，与氨基酸代谢关系最为密切，尤其是支链氨基酸与芳香族氨基酸代谢，表明氨基酸代谢对大曲挥发性化合物的形成有重要影响。在本研究中，氨基酸代谢途径也是仅次于碳水化合物代谢的最活跃代谢途径，其通量水平与温度呈显著正相关，可能与热应激下微生物通过氨基酸降解加速能量供给及渗透保护物质合成有关 。
结 论
本研究通过固态模拟发酵并应用HS-SPME-GC-MS技术解析了温度胁迫对合成菌群挥发性化合物代谢的影响，结合宏转录组学揭示了温度胁迫下合成菌群基因对温度变化的响应规律以及风味表达机制。挥发性化合物检测结果表明，不同温度胁迫下，合成菌群的代谢产物和代谢通路表现出显著差异，在40 ℃条件下，合成菌群的挥发性化合物种类和含量均达到最高，最有利于风味物质的积累。本实验构建的合成菌群有助于激发吡嗪类物质的合成与积累。同时，共筛选出16 种主要差异挥发性化合物。其中，在T30与T40比较组中，有6 种挥发性化合物显著上调；在T30与T50比较组中，有7 种挥发性化合物下调。在T40与T50比较组中，有9 种挥发性化合物显著下调，有1 种挥发性化合物上调。宏转录组分析表明合成菌群在30 ℃和40 ℃环境中的代谢功能较为相似。而在50 ℃条件下，合成菌群的功能发生明显变化。高温胁迫下，合成菌群通过“保核心功能，弃冗余消耗”的策略重新分配代谢资源以应对热应激。在30 ℃条件下，合成菌群主要高表达基因为
BDH
PlsC
plsX
lrgA
dps等，为维持细胞生命活动供能。在40 ℃条件下，主要高表达基因包括
pdc
sucC
gudB
pabA等，维持微生物正常生理活动的同时，具有调控风味物质前体合成的能力。在50 ℃高温发酵条件下，合成菌群主要高表达基因包括
dapD
ilvD
pgm
tpiA
gapA
eno
rpe等，主要是通过能量供应的强化、氧化还原平衡的维持、代谢网络的重构以适应高温胁迫，各温度条件下功能代谢出现明显差异。同时，主要差异挥发性化合物的代谢网络也表明氨基酸代谢对大曲挥发性化合物的形成有重要影响。本研究可为理解温度胁迫对大曲关键菌群的风味代表达机制提供理论基础，为优化控温制曲工艺、提升固态发酵可控性及人工菌剂开发提供理论支撑 。
作者简介
通信作者：
黄永光 教授
贵州大学酿酒与食品工程学院 院长
贵州省酿酒工业协会秘书长、贵州省白酒产业促进会副秘书长、“黔酒工匠”、中国白酒技术委员会委员、全国食品工业科技创新杰出人才、《中国酿造》《酿酒科技》期刊编委等。研究方向包括酿造微生态结构及其代谢调控机理；酿造环境微生物与酿造微生物互作机制；酒类风味结构特征及其风味贡献机制；酒类活性功能成分及其健康饮酒；白酒机械化、智能化酿造关键技术等。主持国家基金、贵州省重大专项、重大成果转化及产学研合作项目30余项，发表SCI、EI等收录论文200多篇，主编、参编专著9 部，起草制定发布标准16 件，获国家发明专利30余件，获国家级、省部级科学技术奖3 项，获中国食品、酒业行业学会、协会科学技术一等奖等10余项 。
第一作者：
王念硕士研究生
贵州大学酿酒与食品工程学院
主要研究方向为大曲微生态解析与资源挖掘 。
引文格式：
王念, 龚佳欣, 唐杰, 等. 基于发酵温度胁迫调控重组菌群的代谢特征及风味表达机制[J]. 食品科学, 2025, 46(22): 227-235. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250515-090.
WANG Nian, GONG Jiaxin, TANG Jie, et al. Regulatory effect of temperature stress on metabolic characteristics and flavor expression mechanism of recombinant microbial communities[J]. Food Science, 2025, 46(22): 227-235. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250515-090.
实习编辑：彤禾；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
为汇聚全球智慧共探产业变革方向，搭建跨学科、跨国界的协同创新平台，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）、中国食品杂志社《食品科学》杂志（EI收录）、中国食品杂志社《Food Science and Human Wellness》杂志（SCI收录）、中国食品杂志社《Journal of Future Foods》杂志（ESCI收录）主办，西南大学、 重庆市农业科学院、 重庆市农产品加工业技术创新联盟、重庆工商大学、重庆三峡学院、西华大学、成都大学、四川旅游学院、西昌学院、北京联合大学协办的“ 第三届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会 ”， 将于2026年4月25-26日 （4月24日全天报到） 在中国 重庆召开。
长按或微信扫码进行注册
会议招商招展
联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）
热门跟贴