Mol Cell | 基因剪刀Cas9的“第二人生”—肖易倍/骆敏/陆美玲/李兆星揭示Cas9参与CRISPR记忆生成的机制|cas|crispr|dna|基因剪刀|序列|李兆星|第二人生|肖易倍|陆美玲|骆敏

提起CRISPR-Cas9，很多人的第一反应都是 “基因魔剪 ” —— 识别靶标、精准切割，改写基因组。但在细菌的CRISPR免疫系统里，决定“能不能精准出刀”的，往往不是切割，而是更早一步的适应阶段（adaptation）—— 把外源DNA的一小段片段筛选、加工并整合进CRISPR阵列，形成可遗传的“免疫记忆”。

CRISPR-Cas系统通过将外源DNA片段写入宿主CRISPR阵列，建立可遗传的“免疫记忆”。在这一过程中，系统不仅要从海量外源DNA中优先锁定带PAM线索的候选片段，还要将其加工成合规的spacer长度并保证方向性整合，才能为后续干扰阶段的精准识别打下基础。然而，在典型II-A型CRISPR系统中Cas1本身并不具备PAM识别能力，这使得“PAM如何被识别并与prespacer选择耦联”长期缺乏直接证据。

2026年2月16日，中国药科大学肖易倍团队和新加坡国大学骆敏团队的合作在MolecularCell发表题为Structural basis for Cas9-directed spacer acquisition in type II-A CRISPR-Cas systems的研究论文，通过解析II-A CRISPR系统中关键适应复合体的多种冷冻电镜结构，阐明该系统中所有四个蛋白，Cas9与Csn2、Cas1-Cas2组装成超级复合体共同完成这一系列流程的分子机制。研究发现：Cas9在适应阶段并非单纯“出手切割”，而是承担前端“侦察 —— 筛查”的关键节点功能，与Csn2共同完成PAM扫描与prespacer定标，并通过“退出”触发整合模块重排，最终将合格片段交由Cas1–Cas2写入CRISPR阵列。

研究团队首先在体外稳定重构了Cas9、Csn2与Cas1–Cas2的四蛋白复合体，并捕捉到其apo状态的“休眠/待命”构象。该超级复合体中Cas9的关键结构域（尤其与活化相关的REC3区域）被Csn2与Cas1–Cas2界面约束在更为闭合的待机构象中，与实验观察到的Cas9 在 Csn2与Cas1–Cas2 存在的条件下切割活性显著降低相一致，提示该装配形态更偏向于DNA侦察与候选片段筛查，从而避免适应阶段的非特异损伤。

为追踪PAM选择过程，研究团队设计了不与crRNA互补但含单一PAM的dsDNA底物。在DNA加入后，原先体积庞大的超级复合体发生显著重排，形成更紧凑的前间隔序列（ prespacer ）捕获复合物。在该状态下，Cas9与DNA形成可滑动、可检验序列的结合方式，提示Cas9可沿DNA进行 P AM扫描验证，并以PAM为关键判据锁定合格候选片段。

更为关键的是，结构显示dsDNA末端被导入Csn2的中心通道，并与复合体构型共同形成一种“导流槽 + 尺子”式的几何约束。在这一约束下，候选DNA片段被定标为约30 bp的标准长度，恰好匹配可被Cas1–Cas2整合的前间隔序列的长度。由此，Cas9负责PAM线索的扫描与验收，Csn2负责末端捕获与长度定标，两者协同将“可用材料”精准交付给 C as1-Cas2整合模块。

研究还捕捉到缺失Cas9的相关结构状态。值得注意的是，Cas9的“退场让路”并非简单解离，而是伴随Csn2–Cas1–Cas2装配体发生重排：原先受约束的PAM近端DNA被暴露出来，使Cas1–Cas2能够更顺畅地装载并进入后续的前间隔序列加工与方向性整合步骤。这一结构开关机制为理解II-A型系统如何完成PAM依赖选择与整合前准备，提供了关键线索。

综上，该研究在结构层面串联了II-A型CRISPR适应阶段的关键事件：休眠态复合体先将Cas9限制在低切割的待机姿态；游离的DNA末端被Csn2捕获后传导至Cas9，随后Cas9沿DNA滑动扫描并识别PAM序列；Csn2和Cas9共同将候选片段定标至约30 bp；随后Cas9解离触发装配体重排，暴露PAM近端DNA并促使Cas1–Cas2接管完成整合。这不仅重新定义了Cas9在细菌免疫中的角色，也为理解CRISPR记忆生成的“质量控制”提供了新的结构框架。

中国药科大学药学院肖易倍教授、生命科学院陆美玲副教授和新加坡国立大学骆敏教授为共同通讯作者，中国药科大学药学院李兆星研究员、博士研究生李钰涛为共同第一作者。此外。中国药科大学陈美容教授；研究生孔健平、吴宛倩、黄平平、曾婷、武倩倩、张煜；本科生刘勇峰、林瀚丰、侯力裘、刘宫羽，新加坡国立大学胡纯一教授、何雨瞳博士，以及艾迪贝克杨振煌博士对本课题的完成均付出了重要的贡献。

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2026.01.024

制版人：十一

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（*排名不分先后）