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Abstract
鉴于镉（Cd）在大米等主食中的严重毒性和广泛存在，准确的饮食暴露评估对公共健康至关重要。体外生物利用度通常用于调节饮食中风险因素的暴露水平；然而，传统的平面Transwell模型有局限性，如细胞去分化和缺乏关键肠道成分，因此需要一个更具生理相关性的体外平台。本研究介绍了一种创新的三维（3D）肠类器官模型，使用微流控芯片评估Cd在食品中的生物利用度。在芯片上培养了Caco-2细胞，以模拟小肠绒毛的三维结构、黏液生成和吸收功能。该模型的生理相关性被彻底表征，显示形成一个汇合的上皮单层，具有发育良好的紧密连接（ZO-1）、高微绒毛密度（F-肌动蛋白）和显著的黏液分泌（阿利新蓝染色），与生理性肠上皮非常相似。荧光粒子跟踪证实了其模拟肠道运输和扩散的能力。通过三维肠道类器官模型（（9.07±0.21）%）测得的大米Cd生物有效性与小鼠模型（（12.82±3.42）%）相当，但显著低于Caco-2单层模型（（26.97±1.11）%）。该三维肠道类器官模型为食品中重金属生物利用度的体外评估提供了一种新颖可靠的策略，对食品安全和风险评估具有重要意义。
Introduction
镉（Cd）是一种毒性极高的重金属，会对健康产生多种不良影响。大米作为主要的饮食主食，可能会从受污染的土壤中积累Cd，从而构成潜在的暴露风险。然而，并非所有存在于大米中的Cd都能被胃肠道吸收，这可能导致风险被高估。已经指出，评估来自食物的有毒物质的摄入量时，不应仅仅考虑其数量，还应考虑其生物可进入性和生物可利用性。在消化过程中，有毒物质可能会从食物基质中部分释放出来。被动员进入消化液（食糜）的有毒物质部分，被定义为生物可进入部分。而生物利用率则指的是生物可吸收的有毒物质中，被吸收并进入血液循环的比例。最近的研究强调，食用大米导致Cd毒性的风险不仅取决于谷物中的总Cd含量，而且关键还在于生物可进入性和生物可利用性的浓度。
虽然在体内进行人类研究是评估Cd的生物可进入性和生物利用度的理想方式，但实际操作上的限制（成本、时间以及伦理问题）往往使得使用体外模型成为必要。人类肠道细胞系（Caco-2）被广泛用作研究毒性物质生物利用度的代表性模型。这种方法涉及将Caco-2细胞接种到Transwell滤器上，以建立一个完整的屏障，从而模拟肠道上皮结构。平面Transwell模型已被用于评估Cd在各种食品基质中的生物可利用性，如大米、猪肾和生菜。然而，平面Transwell模型存在一些明显的局限性，包括细胞主要沿培养皿的水平方向铺展，且容易变得扁平和平复分化，这阻碍了该模型对小肠绒毛三维结构以及分化细胞类型的模拟。此外，体外平面Transwell模型缺乏肠道上皮细胞的关键组成部分，如杯状细胞和黏液层（或黏蛋白），而这些对于肠道腔内物质的吸收是必不可少的。这些局限性突显了需要一种更具生理相关性的体外平台，以便更好地理解Cd或其他毒物在肠道环境中的生物利用度。
一种名为肠道类器官的3D肠道细胞模型已被开发出来，以提供更为逼真的暴露条件和与生理相关的发育过程，从而更准确地展现有害物质在肠道内的吸收情况。例如，通过施加特定的应力，研究已经能够在芯片装置中诱导Caco-2细胞形成三维肠道绒毛结构，从而更好地模拟了实际肠道结构和生理状态。此外，最近的一项研究评估了聚苯乙烯纳米塑料对人类肠道类器官的影响，发现聚苯乙烯纳米塑料在多个细胞中累积，这与2D细胞系中观察到的有限累积情况形成对比。此外，与人类肠道类器官相比，2D细胞系中观察到的细胞凋亡现象更为显著（细胞凋亡率接近体内研究的结果）。这些结果表明，二维细胞系可能并不准确地反映体内肠道环境，从而导致低估了聚苯乙烯纳米塑料对肠道的毒性。然而，目前尚未建立成熟的肠道器官模型来评估Cd在大米中的生物可利用性。这一研究空白使得对通过食用大米摄入的Cd的生物可利用性的理解不足。评估Cd生物可利用性的结果对于准确的风险评估和设定Cd在大米中的监管限值至关重要。
本研究旨在建立一个新型的器官芯片模型，以评估Cd在大米中的生物可利用度。首先，将人类小肠癌细胞系的Caco-2器官模型培养在微芯片上，以紧密复制3D结构、黏液产生以及与小肠绒毛类似的吸收功能。将通过评估其形态、分化细胞标志物、渗透性和结构完整性，来评估此模型的生理相关性。随后，将在器官芯片模型和传统的平面Transwell模型之间比较Cd的生物可利用度。本研究将为评估Cd在大米中的水平以及设定标准提供重要的理论支持。
Results and Discussion
在Transwell腔室中Caco-2细胞的生长以及Cd的生物可利用性
在Caco-2细胞单层模型中，Transwell腔室的结构以及Caco-2细胞在腔室中的生长和分布情况如图1A所示。Transwell腔室上方的空间被定义为顶端面（AP），而腔室下方的空间则被定义为基底面（BL）。由于Caco-2细胞最初被接种在Transwell腔室的顶端面，因此它们均匀地分布在了多孔的聚酯透明膜上。经过21 d的培养，Caco-2细胞生长并分化形成了一层致密的单层上皮细胞结构。
在亮视野光学显微镜下观察到了Caco-2细胞形态，如图1B所示。在接种初期，Caco-2细胞分布均匀。在第3和第8天，Caco-2细胞数量显著增加，且细胞变得扁平且形状不规则，这表明细胞在快速生长并形成平面膜结构。在第21天，Caco-2细胞分布得非常密集，细胞之间没有间隙，界限清晰，表明细胞之间形成了紧密连接。观察到一些微小的“团块”，这表明Caco-2细胞已经分泌了少量黏液。TEER测量被用来确认细胞屏障的完整性，然后再研究离子、化学物质或药物的跨上皮转运。在这项研究中，经过21 d的培养，Caco-2细胞的TEER值达到了600 Ω/cm2。有报道指出，TEER值≥200 Ω/cm2可以被认为是紧密连接且相对完整的细胞单层的表现。并且在分化过程中，TEER值大于250 Ω/cm2的模型可以被用于肠道吸收研究。因此，可以得出结论，经过21 d的生长和分化，Caco-2细胞在Transwell分区的AP中已经形成了一个完整且致密的肠道单层上皮细胞结构。Cd在体外的生物利用率是指Cd在模拟胃肠道消化过程中从食物基质中释放出来并被Caco-2细胞吸收的程度。如图1C所示，来自“Rice-N+CdCl2”组的Cd的生物利用率（（30.04±1.49）%）显著高于“Rice-M”组（（26.97±1.11）%），这表明与来自大米基质中的Cd相比，无机Cd更容易被小肠吸收。CdCl2组的生物利用率（（35.04±1.63）%）在所有组中是最高的，这表明大米基质显著影响了Cd在体外的生物可利用性。先前的研究已经报告，Cd的生物利用率受到大米化学成分的影响，与钙和支链淀粉含量呈正相关，而与硫、磷、植酸和粗蛋白含量呈负相关。更高的钙、铁或锌浓度会降低Cd的生物可利用性。此外，大米基质中必不可少的二价金属离子，如Fe2+、Mn2+、Zn2+和Cu2+，可能与Cd竞争，与位于小肠上皮细胞顶侧的转运分子结合，从而导致Cd的吸收率降低，或者与这些必不可少的二价金属离子相比，其生物可利用性相似。
3D肠道器官模型的分化与形成
在微流体芯片中形成3D肠道器官模型
微流体芯片设备如图2所示。不同体积的介质被添加到不同侧面的培养介质腔中，从而产生流体剪切力（图2A）。将含有Caco-2细胞的凝胶溶液注入细胞凝胶通道并孵育后，凝胶内的细胞密度增加（图2B）。流体剪切力刺激了Caco-2细胞，经过96 h的孵育，细胞形成了波动性的上皮细胞结构（图2B）。在整个生长过程中，Caco-2细胞被限制在芯片内，随后分化形成3D肠道器官模型，从而可以进行原位追踪和实时成像。此外，细胞凝胶通道的形状和尺寸有效地防止了相邻球体在培养过程中的融合，克服了传统悬浮培养方法的局限性。
紧密连接的形成以及刷状缘和微绒毛的发展
为了评估肠道器官样在微流体芯片中的生长情况，在96 h的培养期间观察了器官样组织形态的变化。器官样形状随时间变化的情况如图3A所示，芯片上实现了自发的肠道形态发生。最初，接种的Caco-2细胞均匀分布在凝胶通道中，呈现出圆形形态。经过48 h的培养，微通道中偶有上皮细胞凝聚的现象出现，表明细胞已形成波浪状结构。经过96 h的培养，可以看到三维上皮细胞层的连续突起，表明细胞发展出了更为明显的波浪状结构，类似于体内小肠上皮细胞的折叠结构。体内的小肠特征在于环状折叠以及腔内突起的杯状细胞。
紧密连接蛋白ZO-1的表达是肠道上皮细胞的一个关键特征。作为紧密连接复合体的重要组成部分，ZO-1在调节肠道上皮细胞的通透性方面起着至关重要的作用。免疫荧光染色显示，微流体芯片中形成了一致的上皮单层，且紧密连接结构发育良好（图3B）。这与分化的人Caco-2细胞表现出“铁丝网围栏状”的有组织结构的观察结果一致，这表明了紧密连接的形成。此外，正如蓝色箭头所示，免疫荧光染色证实了该器官组织的肠道隐窝结构（图3B）。这与在小鼠中观察到的肠道隐窝结构非常相似。隐窝结构的一个典型特征是，通过顶端膜内陷，形成T形膜内陷（T-褶皱），从而改变了肠道上皮的结构。“铁丝网状”结构展示了细胞处于扁平状态，而“肠隐窝”结构则展示了三维状态。在肠道发育过程中，肠道上皮细胞逐渐从最初的扁平状态发展至立体状态。据报道，在小鼠中，肠道隐窝的形成始于出生后第一周，而在人类中，肠道隐窝的形成则发生在早期妊娠阶段（第11至第12周）。在那之前，细胞排列成一片扁平的薄片，并没有明显的类似隐窝的结构。微绒毛是肠道刷缘结构的一个组成部分，其特征在于绒毛状蛋白质。如图3C所示，绒毛状蛋白质在3D肠道器官模型中分布密集（绿色），这表明形成了许多微绒毛。如图中蓝色箭头所示，肠道器官模型中微绒毛的分布与在小鼠肠道中观察到的略有不同（图3B）。当前的器官模型培养系统并不能完全模拟体内肠道复杂生长的环境，因此导致了某些组织上的差异。肠道器官模型主要由肠道上皮细胞组成，缺乏必要的成分，如结缔组织、肌肉组织和神经组织。此外，它们不包含血管、淋巴管，也不支持神经发生，并且缺乏免疫细胞和平滑肌细胞。此外，细胞来源和培养条件的差异也会影响器官球的结构。目前，细胞来源的多样性以及培养技术缺乏标准化导致了研究结果的巨大变异性。微绒毛发育的程度可以通过扫描电子显微镜进行进一步研究。
黏液分泌与肠道转运/扩散
黏液分泌是肠道上皮细胞的一个关键特征。黏液层在人体内扮演着重要的物理屏障角色，将肠道细菌与上皮表面隔离开来。此外，这种黏液还能促进到达肠道壁的物质的扩散，使其能够接触到肠道上皮细胞。因此，在不同时间点使阿利新蓝染色测量了Caco-2细胞的黏液分泌情况，蓝色区域代表黏液。如图4A所示，染色结果显示在微流体芯片中的Caco-2细胞层表面存在显著的黏液分泌现象。这种黏液层的存在展示了3D肠道器官在体外的生理功能。相比之下，Caco-2细胞单层模型中则未发现黏液。先前的研究已经报道了一种构建肠道-黏液系统的方法，即通过在培养的肠道细胞表面覆盖黏蛋白（肠道黏膜层的主要成分）来模拟生理环境。与这种方法相比，当前研究的优势在于构建的3D肠道类器官模型能够独立地进行分化，并展现出黏液分泌功能。图4B显示了装载到3D肠道类器官模型中的荧光颗粒的分布情况。随着时间的推移，一些荧光颗粒穿过模型，进入另一侧的媒介通道中，而有些颗粒则仍留在类器官内。这些结果表明，本实验中使用的微流控芯片能够模拟肠道的转运和扩散过程。总体而言，综合分析显示，微流控芯片模型中肠道上皮细胞的分化效率较高，且肠道的关键功能特性也得到了体现。
3D肠道器官模型中的Cd生物利用率
如图5所示，在3D肠道器官模型中，大米中Cd的平均生物利用率是（9.07±0.21）%，这与小鼠模型中的数据相似，后者为（12.82±3.42）%，但显著低于Caco-2细胞单层模型中的数值（（23.72±0.78）%。这些结果表明，在3D肠道器官模型中，大米对Cd的吸收情况与体内情况非常接近，但与2D细胞培养模型存在显著差异。Cd的肠道吸收是通过多种转运蛋白（如DMT-1或钙通道）实现的。据报道，二维细胞系在Cd诱导下可以表达更多的转运蛋白。这也许可以解释为什么在3D肠道器官模型中，Cd的平均生物利用度显著低于Caco-2细胞单层模型中的生物利用度。在对照组中，3D肠道器官模型和小鼠模型中CdCl2的生物利用度与大米中的Cd相似，这表明在这些模型中大米基质对Cd生物利用度的影响可以忽略不计。3D肠道器官模型的结构和功能评估显示，它们高度代表了体内小肠的生理结构和特性（图3和图4），这或许可以解释为什么在这个模型中Cd的生物利用度与在小鼠模型中的非常接近。
先前的研究已经分析了重金属在食品底物（包括大米）体外模拟胃肠道消化过程中的生物可及性与其在体内的生物利用度（小鼠模型）之间的相关性，旨在通过体外生物利用度预测体内生物利用度。然而，模拟消化液的参数（如pH值和酶）以及食物底物的类型显著影响了重金属的生物可及性，限制了使用生物可及度来预测体内生物利用度的可靠性。本研究构建的三维肠类有机体模型可以直接反映Cd在体内的实际生物利用度，不受大米底物的影响。这是一个有意义的尝试，为准确预测食物基质中重金属的体内生物利用度提供了新的视角和重要参考。此外，本研究中获得的生物利用度（9.07%）被用来估算不同国家的每日Cd摄入量。如表1所示，当考虑生物利用度时，发现每天的Cd摄入量从4.6～34.6降低到0.42～3.14 μg/d。根据总浓度计算的每日Cd摄入量，比根据Cd生物利用度计算的高估了Cd暴露量11.03倍。此外，根据生物可利用Cd计算的成人膳食中Cd的估计摄入量占欧洲食品安全局推荐的TDI值的1.95%～14.66%。
表1 Cd每日估计摄入量的总量和生物利用度值
3D细胞培养模型，如器官原位体，已成为研究人类发育和疾病方面优于传统2D单层培养的优越替代方案。器官原位体具有自我组织的能力，能够形成其原组织的小型化且功能完整的版本，从而更准确地重现原始器官的复杂性和生理特性。本研究展示了3D Caco-2细胞衍生的肠道器官作为更具代表性的体外模型，相较于传统的2D培养，在模拟人类肠道组织方面具有优势。尽管这些肠道器官尚未完全重现与肠道不同区域（如空肠、十二指肠、回肠和结肠）相关的复杂结构和细胞相互作用，但它们包含了小肠中特有的细胞类型，包括杯状细胞和刷状缘细胞，并展现出类似肠道的结构特征（图3）。这表明3D肠道器官可以作为有价值的基础研究和转化研究工具。
基于器官模型的模型已成功用于研究各种疾病并筛选新的治疗化合物。这些3D结构能够以类似于体内条件的方式忠实模拟人类器官发育、形态和生理机能的能力，已经得到了充分的证明。本研究进一步扩展了肠道器官组织在Cd吸收研究中的应用，展示了其作为创新研究平台的多功能性。尽管对肠道芯片进行了广泛的研究，但其主要应用仍主要集中在药物吸收和活性评估方面。本研究的独特之处在于对肠道芯片的创新应用，用于评估重金属的生物利用度，从而为食品安全评估提供了一个新的视角。这一探索旨在促进对重金属对人类健康潜在影响的更全面理解。此外，已成功开发了一种具有微绒毛结构的3D肠道器官组织，这在现有文献中是首次实现，这一成果是通过精确控制流体压力和培养条件而获得的。研究进一步提出，传统的平面模型在评估重金属Cd的生物利用度时可能会导致对食品安全风险的高估，这强调了评估方法的重要性，并为更深入地理解重金属对健康的潜在影响提供了关键见解。总之，本研究填补了现有文献中的一个显著空白，强调了使用更精确模型进行重金属风险评估的必要性和紧迫性。
Conclusion
本研究引入了一个3D肠道类器官模型来研究Cd在大米中的生物利用率。该生物模拟平台构建于微流控芯片上，使得Caco-2细胞能够形成紧凑、波浪状的肠道上皮层结构。与传统的Caco-2细胞单层模型相比，本研究中开发的3D肠道类器官系统更准确地模拟了生理性的肠道微环境及功能。此外，3D肠道类器官模型能够直接反映Cd在大米中的体内生物利用率，而不受大米基质的干扰效应影响。这一创新模型为可靠评估食品基质中重金属的体内生物利用率提供了一种新策略。本研究的结果展示了3D肠道类器官作为改善体内生物利用率评估的有用工具的价值，对食品安全和风险评估具有显著意义。
Innovative 3D microfluidic intestinal organoid model for assessing cadmium bioavailability in food: implications for enhanced exposure risk assessment
Yan Lia,b,1, Wen Suna,b,1, Qiao Wangc, Wan Shic, Yu Chend, Zhiyong Gongc, Xiao Guoc,*, Xin Liuc,*, Yongning Wuc,e,*
a Key Laboratory of Animal Biological Products & Genetic Engineering, Ministry of Agriculture and Rural, Sinopharm Animal Health Co., Ltd., Wuhan 430023, China
b State Key Laboratory of Novel Vaccines for Emerging Infectious Diseases, China National Biotec Group Co., Ltd., Beijing 100024, China
c Key Laboratory for Deep Processing of Major Grain and Oil (The Chinese Ministry of Education), College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China
d Department of Oncology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China
e NHC Key Laboratory of Food Safety Risk Assessment, China National Center for Food Safety Risk Assessment, Beijing 100021, China
1 Both authors contributed equally.
*Corresponding author.
Abstract
Given the severe toxicity and widespread presence of cadmium (Cd) in staple foods such as rice, accurate dietary exposure assessments are imperative for public health. In vitro bioavailability is commonly used to adjust dietary exposure levels of risk factors; however, traditional planar Transwell models have limitations, such as cell dedifferentiation and lack of key intestinal components, necessitating a more physiologically relevant in vitro platform. This study introduces an innovative three-dimensional (3D) intestinal organoid model using a microfluidic chip to evaluate Cd bioavailability in food. Caco-2 cells were cultured on the chip to mimic small intestinal villi’s 3D structure, mucus production, and absorption functions. The model’s physiological relevance was thoroughly characterized, demonstrating the formation of a confluent epithelial monolayer with well-developed tight junctions (ZO-1), high microvilli density (F-actin), and significant mucus secretion (Alcian blue staining), closely resembling the physiological intestinal epithelium. Fluorescent particle tracking confirmed its ability to simulate intestinal transport and diffusion. The Cd bioavailability in rice measured by the 3D intestinal organoid model ((9.07 ± 0.21)%) was comparable to the mouse model ((12.82 ± 3.42)%) but significantly lower than the Caco-2 monolayer model ((26.97 ± 1.11)%). This 3D intestinal organoid model provides a novel and reliable strategy for in vitro assessment of heavy metal bioavailability in food, with important implications for food safety and risk assessment.
Reference:
LI Y, SUN W, WANG Q, et al. Innovative 3D microfluidic intestinal organoid model for assessing cadmium bioavailability in food: implications for enhanced exposure risk assessment[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(5): 9250364. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250364.
翻译： 罗敬（实习）
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片：图虫创意
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