MKN74细胞培养攻略
MKN74 是一种人胃癌细胞系，最初由日本国立癌症研究所从一名37岁男性患者的肝转移病灶中分离，患者罹患的是中分化管状腺癌。MKN74细胞具有与肠道分化相关的形态学特征，包括在体外及裸鼠模型中观察到的细胞极性和具有核心丝的微绒毛。
一、细胞介绍
1.1.细胞参数
【细胞名称】 MKN74细胞（人胃癌细胞）
【细胞别称】 MKN-74; MKN74
【种属来源】 人
【组织来源】 日本一名37岁男性胃中等分化腺癌患者的胃癌肝转移灶
【细胞类型】 肿瘤细胞
【年龄/性别】 37岁/男性
【生长特性】 贴壁生长
【生物安全等级】 BSL-1
【倍增时间】 42-49h
【细胞形态】 上皮细胞样
【病毒感染】 EBV、HBV、HIV-1、HIV-2阴性
【培养体系】 RPMI1640 + 10% FBS + 1% P/S
【培养条件】 37°C、5% CO2
【推荐传代比例】 1:2-1:6,
【换液频率】 每周2次
【冻存条件】 液氮保存
【保藏机构】 CLS; 300490
JCRB; JCRB0255
KCLB; 80104
RCB; RCB1002
【p53基因状态】 多数为野生型,部分存在I251L点突变
【RUNX3 mRNA】 表达缺失
【SNCG基因】 表达突触核蛋白γ基因,可促进增殖转移
【肿瘤干细胞研究】 用于胃癌干细胞的分离培养和鉴定
【肿瘤机制研究】 探索胃癌发生发展的分子机制
【药物筛选】 用于抗肿瘤药物的体外筛选和评价
所用产品：
1.2.质控信息
【无菌检测】 阴性
【支原体检测】 阴性
【物种/STR鉴定】 正确
二、培养操作
/ 金源康生物 /
2.1、复苏培养操作
（1）恒温水浴锅预热至37℃备用，或者细胞复苏仪开机预热准备；
（2）准备15ml离心管，并向其中加入8ml完全培养基（JYK-CT-0165M）待用；
（3）将细胞冻存管从-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入恒温水浴锅中或者直接置于细胞复苏仪中；
（4）在恒温水浴锅中，用力摇晃冻存管，使其在1分钟内融化；在细胞复苏仪中，按照程序操作即可；
（5）用纸巾或无尘布擦拭水渍，75%酒精消毒后转移至生物安全柜或者超净工作台。用移液枪吸取细胞悬液，缓慢滴加到步骤2中准备好的离心管；
（6）1000rpm离心5min；
（7）弃上清，用新鲜完全培养基（JYK-CT-0165M）重悬细胞，混匀取样20ul计数后，根据实验需要接种至新的无菌培养器皿中；
（8）镜检细胞状态，拍摄100x、200x照片各3张；
（9）置于37℃，5%CO2培养箱中进行培养，24h后镜检观察细胞复苏情况（贴壁情况）。
所用产品：
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2.2、传代培养操作
（1）取培养中的细胞，镜下观察细胞汇合度和生长状态，若细胞汇合至90%以上，即可传代，拍摄100x、200x照片各3张；
（2）去除培养上清，加入PBS（JYK-SH-001）清洗细胞（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）；
（3）加入0.05%胰酶（JYK-SX-001）（T25瓶，加入2ml；T75瓶，加入4ml），放入培养箱中或者室温下消化解离3min左右，可用显微镜观察状态，若观察到细胞离散成单个圆形、细胞间出现间隙、呈沙状移动，并悬浮在培养液中即可；
（4）加入完全培养基（JYK-CT-0165M）（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）终止消化，反复吹打瓶底和细胞，使其充分悬浮并吸取到离心管中，用PBS（JYK-SH-001）（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）再洗培养瓶一次，将两次液体收集到一支离心管中；
（5）1000rpm离心10min；
（6）离心后弃上清，轻轻敲击细胞沉淀，使其散开，加入1ml完全培养基（JYK-CT-0165M）稀释并充分混匀；
（7）计数，吸取细胞液20ul，加入20ul台盼蓝染液，混合均匀后吸取20ul混合液加入到细胞计数板计数，根据接种密度计算所需细胞液体积；
（8）根据实验需要，吸取一定量的细胞液加入到培养瓶，加入完全培养基（JYK-CT-0165M）（T25瓶，加入10ml；T75瓶，加入20ml），轻轻前后摇匀，在瓶身写好细胞名、培养代数、日期、姓名；
（9）镜下观察看是否已经摇匀，无误后放入培养箱37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养。
所用产品：
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2.3、冻存操作
（1）取培养中的细胞，镜下观察细胞汇合度和生长状态，若细胞汇合至90%以上，即可传代，拍摄100x、200x照片各3张；
（2）去除培养上清，加入PBS（JYK-SH-001）清洗细胞（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）；
（3）加入0.05%胰酶（JYK-SX-001）（T25瓶，加入2ml；T75瓶，加入4ml），放入培养箱中或者室温下消化解离3min左右，可用显微镜观察状态，若观察到细胞离散成单个圆形、细胞间出现间隙、呈沙状移动，并悬浮在培养液中即可；
（4）加入完全培养基（JYK-CT-0165M）（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）终止消化，反复吹打瓶底和细胞，使其充分悬浮并吸取到离心管中，用PBS（JYK-SH-001）（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）再洗培养瓶一次，将两次液体收集到一支离心管中；
（5）1000rpm离心10min；
（6）离心后弃上清，轻轻敲击细胞沉淀，使其散开，加1ml预冷冻存液（JYK-SD-003）混匀；
（7）计数，吸取细胞液20ul，加入20ul台盼蓝染液，混合均匀后吸取20ul混合液加入到细胞计数板计数；
（8）根据计数结果，添加冻存液（JYK-SD-003），调整细胞最终密度为3×106/ml；
（9）将细胞分装入冻存管中，每管1ml；
（10）冻存管标记细胞名称，细胞代数、细胞密度、冻存时间，操作者。
（11）按照冻存程序进行细胞冻存。参考冻存程序见下表：
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三、注意事项
1.若细胞生长速度缓慢，可尝试添加5-10 ng/mL的表皮生长因子（EGF）或胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）补充剂，以促进细胞增殖。
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文字供稿 | 金源康-细胞资源库
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最终审核 | 金源康-王宏
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