2026年2月24日，中医药功能成分发现与利用国家重点实验室、中药标准化重点实验室、上海中医药大学中药综合药重点实验室、上海中医药大学中药研究所、王长虹教授团队在Journal of Ethnopharmacology (IF=5.4，中科院2区，Q1)在线发表题为“Discrimination of the significance of astragalosides in Astragalus radix based on the in vivo exposure levels and pharmacokinetic characteristics of prototype saponins and their metabolites: A strategy for discovering and confirming quality markers”（基于原型皂苷及其代谢物的体内暴露水平和药代动力学特征，区分黄芪中黄芪皂苷的重要性：发现和确认质量标志物的策略）的研究论文。
亮点
•采用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时测定大鼠血浆中的五种黄芪甲苷。
•在大鼠口服给予单个黄芪甲苷后，CA 显示出最高的血浆暴露量。
•与 ASⅡ 和 ASⅣ 相比，ASⅠ 和 ASⅢ 在胃肠道中转化为 CA 的速度更快。
•潜在 Q 标记的重要性取决于它们转化为 CA 的速率和程度。
•体内ADME特性可以作为筛选 Q 标记物的有效策略之一。
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【摘要】
民族药理学相关性
黄芪（Astragali Radix，AR）是蒙古黄芪（Astragalus membranaceus var. mongholicus (Bge) Hsiao）或黄芪（A. membranaceus (Fisch.) Bge）的干燥根。黄芪在中国已有两千多年的食用历史，因其具有健脾益气的药用功效，被用作滋补品。黄芪中含有黄芪甲苷Ⅰ（ASⅠ）、黄芪甲苷Ⅱ（ASⅡ）、黄芪甲苷Ⅲ（ASⅢ）、黄芪甲苷Ⅳ（ASⅣ）和环黄芪醇（CA），这些成分具有多种药理活性。然而，目前黄芪的质量控制方法主要集中于黄芪甲苷Ⅳ，而忽略了其他黄芪甲苷的作用，因此无法客观、全面地反映黄芪的质量。
研究目标
本研究旨在通过口服黄芪甲苷后原型皂苷及其代谢物的体内暴露水平和药代动力学特征，证明主要黄芪甲苷的重要性，为建立以黄芪甲苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ为质量标志物（Q标志物）的多组分质量控制体系提供科学依据。
材料与方法本研究建立了一种超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（UHPLC-ESI-MS/MS）方法，用于全面评价大鼠口服等摩尔剂量的ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ和CA五种主要成分及其水提物（WEA）后的体内行为（药代动力学参数）。通过测定这些皂苷成分在体内转化为CA的速率和程度，确定了它们作为潜在Q标志物的重要性。随后，建立了一种超高效液相色谱-蒸发光散射检测器（UHPLC-ELSD）方法，并应用于测定AR样品中ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ的含量。结果UHPLC-ESI-MS/MS 方法具有优异的特异性、准确度、精密度和稳定性，且基质效应和回收率均可接受。当大鼠口服等摩尔剂量的 ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ、CA 和 WEA 时，最显著的特征是它们主要以代谢物 CA 的形式存在于血液中。口服等摩尔剂量的 ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ、CA 和 WEA 后，由 ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ、CA 和 WEA 转化而来的 CA 的特征药代动力学参数如下：最大峰浓度 (C max ) 分别为 43.73、20.58、100.09、44.20、308.59 和 21.96 ng/mL；达峰时间 (T max ) 分别为 11.33、8.67、6.67、8.00、1.00 和 9.33 h。各组的浓度-时间曲线下面积（AUC (0-t)）分别为600.08、250.92、1032.90、464.18、984.09和173.49 μg/L·h。CA组表现出最快的全身吸收和最高的生物利用度，ASⅢ组的转化动力学和效率最佳，ASI组紧随其后，并表现出更长的药理持久性。相比之下，ASⅣ和ASⅡ组的转化效率较低，且在循环系统中可检测到原型化合物。大鼠口服WEA后，CA的血浆浓度最高，而原型化合物ASⅡ和ASⅣ的含量极低，未检测到原型化合物ASⅠ或ASⅢ，这证实了与ASⅡ和ASⅣ相比，ASⅠ和ASⅢ在胃肠道中更快地转化为CA。采用经验证的UHPLC-ELSD方法测定AR中ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ和CA的丰度，结果顺序为：ASⅠ > ASⅡ > ASⅣ ≥ ASⅢ 。结论本研究首次系统地评价和比较了口服等摩尔剂量黄芪甲苷后，黄芪甲苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ在体内转化为黄芪甲苷（CA）的速率和效率。结果表明，黄芪甲苷Ⅰ和Ⅲ的转化动力学和效率均优于黄芪甲苷Ⅳ和Ⅱ。结合黄芪甲苷在体内的转化和暴露特征及其在黄芪甲苷中的含量，黄芪甲苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ可作为潜在的多指标标志物，用于控制黄芪甲苷在黄芪甲苷中的质量。主要活性成分的体内ADME过程特征可作为筛选中药材或其他药材潜在客观质量标志物的有效策略之一。。
01
研究背景及科学问题
黄芪（AR）显著的药理作用归因于其生物活性成分，其中皂苷是最具特征性的成分之一。目前已从黄芪中鉴定出约160种皂苷，包括142种环阿屯烷型三萜皂苷和19种四环齐墩果烷型五环三萜皂苷（Peng et al., 2023）。环阿屯烷型三萜皂苷含有多种苷元，包括环阿特拉醇（CA）、环棘霉素和环加列基宁。其中，CA衍生的黄芪甲苷主要包括黄芪甲苷Ⅰ（ASⅠ）、黄芪甲苷Ⅱ（ASⅡ）、黄芪甲苷Ⅲ（ASⅢ）、黄芪甲苷Ⅶ（ASⅦ）和乙酰黄芪甲苷（AAS）。齐墩果烷型三萜皂苷具有五环结构，主要以大豆皂苷元为苷元，具有显著的生物活性，广泛分布于豆科植物中。AR中主要皂苷的化学结构见补充材料图S1，图1展示了主要成分ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ、CA以及代谢中间体环皂苷（Cyc C）和短皂苷B（Bra B）的化学结构。
图 1.黄芪甲苷Ⅰ（ASⅠ）、黄芪甲苷Ⅱ（ASⅡ）、黄芪甲苷Ⅲ（ASⅢ）、黄芪甲苷Ⅳ（ASⅣ）、环黄芪醇（CA）、环黄芪苷（Cyc C）和短苷B（Bra B）的化学结构。
药理学研究和临床试验表明，黄芪甲苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ具有多种治疗作用，包括抗炎（Yang等，2020）、抗氧化（Liu等，2017）、抗凋亡（Xu等，2021）、抗纤维化（Zhang等，2022）和抗肿瘤活性（Sheng等，2024）。近年来，黄芪甲苷苷元（CA）的药理活性也日益受到关注。除了其已知的抗炎和免疫刺激作用外，CA还因其端粒酶激活特性和潜在的抗衰老应用而备受研究关注（Molgora等，2013）。
为了提升中国中药产品的质量和质量控制标准，刘等人于2016年提出了中药质量标志物（Q-markers）的新概念（Zhang et al., 2017 , 2018 , 2019）。该概念针对中药体系的独特特征，包括其生物学特性、生产工艺和方剂理论。Q-markers的基本标准定义如下：中药材及其制品中固有的次生代谢产物，或在加工制备过程中形成的化学物质；特定中药材（或其加工制剂）所特有的、不来源于其他中药材的化学物质；具有明确的化学结构和生物活性；能够进行定性鉴定和定量分析；根据中药方剂配伍原则，优先选择“主药材”。药物通过特定的给药途径进入血液循环，经过代谢和分布，产生特定的生物学效应。因此，进入血液循环的成分及其代谢产物才是最终的“活性成分”。从质量传递和可追溯性的角度来看，血液中的活性成分代表了质量传递体系的最终阶段，也是确定中药质量指标的关键依据。
在过去的四十年里，包括现行的2025版《中国药典》，黄芪甲苷（ASIV）一直被用作黄芪甲苷类化合物（AR）的质量控制物质（Yang，2023；Yu等，1986；Zhang等，2010）。历史上，黄芪甲苷测定的样品前处理方法涉及复杂且耗时的提取步骤。尽管方法不断改进，但样品前处理过程仍然费力且效率低下。Zuo等（ Zuo，2022 ）在所检测的黄芪甲苷样品中鉴定出黄芪甲苷Ⅰ、黄芪甲苷Ⅱ和芒柄花苷是含量最高的三种成分。Dan等（ Dan，2023 ） Chen等人（2023）和Dan（2023）对多个黄芪样品进行了全面的含量测定，结果表明，不同栽培年份和生长模式下，黄芪甲苷的含量呈现一致的顺序，即ASⅠ > ASⅡ > ASⅢ ≥ ASⅣ，其中ASⅠ和ASⅡ在药材中的含量显著高于ASⅣ。值得注意的是，添加氨水作为提取溶剂可使ASⅠ、ASⅡ以及其他黄芪甲苷发生定量和定性转化，转化为ASⅣ。然而，这种转化过程并不完全，通过这种非环保方法获得的ASⅣ含量无法准确反映黄芪的真实品质（Liu等人，2022）。由于黄芪药材中黄芪甲苷含量较低，因此难以直接从黄芪中提取和分析。目前制备柠檬酸（CA）的方法主要包括通过酸水解（Chu et al., 2019）、Smith降解（Feng et al., 2014）、酶水解（Cheng et al., 2020 ; Li et al., 2019）或微生物转化（Takeuchi et al., 2022）等途径转化ASIV。然而，这些方法受限于高昂的生产成本和环境污染问题。虽然人们已经探索了更环保的酵母合成方法，但尚未成功应用。因此，柠檬酸仍然不适合作为抗性（AR）的质量标志物（Yuan et al., 2023）。
本文系统综述了黄芪甲苷和CA在体内外的代谢转化和药代动力学特征，详见补充材料图S2。大多数黄芪甲苷在中性条件下保持稳定，而AAS、ASⅠ、ASⅡ以及异黄芪甲苷Ⅰ（iso-ASI）、异黄芪甲苷Ⅱ（iso-ASⅡ）在酸性或碱性条件下会转化为ASⅣ（Chu et al., 2014）。黄芪甲苷的生物转化途径包括肠道菌群、真菌和酶促途径，通过脱乙酰化、脱糖基化和脱氢反应，生成环苷B（Cyc B）、短苷B（Bra B）、CA、异环黄芪醇（iso-CA）和脱氢环黄芪醇等代谢产物（Li et al., 2024）。值得注意的是，乳杆菌和双歧杆菌菌株主要介导黄芪甲苷（ASⅣ）向黄芪甲苷（CA）的转化，其中C-6葡萄糖水解被认为是CA的潜在限速步骤（Takeuchi et al., 2022 ; Zhou et al., 2012）。黄芪甲苷在体内的主要代谢部位是胃肠道，其主要代谢途径包括脱糖基化、甲基化、脱乙酰化和还原（Jin et al., 2015）。
对于CA而言，肝脏是主要的代谢器官，介导包括脱氢、脱羟基和脱水在内的氧化转化。这些代谢修饰主要发生在9,19-环丙烷环和20,24-呋喃环部分（He et al., 2022 ）。目前的药代动力学研究表明，ASⅠ和ASⅡ在体内首先代谢为ASⅣ ，随后ASⅣ脱糖基化形成CA，进入体循环发挥药理作用。当大鼠口服总黄芪甲苷或ASⅠ和ASⅡ的单体化合物时，给药物中ASⅠ和ASⅡ的含量显著高于ASⅣ。然而，在血浆中检测到的ASⅣ浓度高于其他黄芪甲苷。因此，既往研究一致认为，黄芪甲苷主要通过在体内转化为ASⅣ发挥其药理作用（Guo et al., 2019）。值得注意的是，单体黄芪甲苷IV（ASⅣ）给药后，血浆中可检测到黄芪甲苷（CA）和异构体黄芪甲苷（iso-CA），其中CA的血浆浓度和生物利用度均高于ASⅣ。这些发现强烈提示CA可能是黄芪甲苷发挥药理作用的主要生物活性代谢物（He et al., 2018）。Meng et al.（2018）研究了人肠道菌群将ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ转化为CA的相对转化效率，揭示了以下代谢层级：ASⅢ > ASⅠ > ASⅡ > ASⅣ。体外肠道菌群研究中观察到的ASⅠ和ASⅢ转化为CA的转化率和效率高于ASⅡ和ASⅣ，表明体内黄芪甲苷生物转化存在其他代谢途径。因此，各黄芪甲苷转化为CA的动力学和效率是选择最佳AR质量标志物的关键参数。
本研究首先旨在探讨大鼠口服等摩尔剂量的黄芪甲苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、CA及黄芪水提取物（WEA，以总黄芪甲苷含量计算）后，不同黄芪甲苷在体内的作用，随后测定不同时间点血浆中母体化合物及其代谢物的浓度。考虑到这些皂苷成分在体内转化为CA的速率和程度，本研究确定了它们作为潜在质量标志物的重要性。最后，通过对多批次黄芪样品中黄芪甲苷含量的定量分析，本研究充分证实了选择多种成分作为黄芪质量标志物的合理性。
02
重要发现及亮点
3.1样品制备方法和仪器条件的优化
在药代动力学研究中，生物样品通常浓度较低且含有多种干扰物质。为了最大限度地减少杂质干扰并改善分析环境，样品通常需要在测量前进行分离、纯化和富集等预处理步骤。常用的样品预处理方法包括：蛋白质沉淀、液液萃取、固相萃取和化学衍生化（Tao et al., 2018）。经比较，蛋白质沉淀法被认为是最合适的。优化的样品预处理方法如下：将CS或QC溶液（50 μL）与空白血浆（50 μL）和内标（IS，50 μL）混合，然后加入乙腈（800 μL）作为蛋白质沉淀剂。如图S3所示（见补充材料），在考察该方法的基质效应时，最初仅加入200 μL乙腈进行样品蛋白质沉淀。研究发现，ASⅠ和ASⅡ的基质效应始终低于规定范围，且在样品中观察到ASⅠ和ASⅡ向其异构体（iso ASⅠ和iso ASⅡ）的转化。相比之下，未经处理的QC和CS溶液中未发生此类转化。推测ASⅠ和ASⅡ的转化是由蛋白质沉淀不完全引起的。目前尚无相关文献报道证实这一现象。为了降低基质效应，对样品预处理过程的每个步骤进行了优化（Qu et al ., 2014 ; Shaw et al., 2012 ; Xu et al., 2013）。首先，考察了沉淀剂的种类。与甲醇和甲醇：乙腈（1:1）相比，乙腈具有更强的蛋白质沉淀能力，能够抑制分析物的转化，如图S4所示（见补充材料） 。其次，沉淀剂的用量也是一个关键因素，我们测试了200~800 μL乙腈的沉淀效果。补充材料图S5的结果表明，800 μL乙腈的效果最佳。在氮气吹扫过程中，温度可能影响分析物的催化转化（Zheng et al., 2014 ）。如图S6所示，在室温（约25 °C）水浴中，分析物的转化率低于37 °C时的转化率。最后，我们测试了复溶溶剂的类型。补充材料图S7展示了用乙腈或50%乙腈水溶液复溶干燥样品的效果，结果表明50%乙腈水溶液明显更合适。
优化色谱条件以增强分析物峰的响应。对流动相进行了研究。研究表明，在流动相中添加甲酸可以促进分析物的电离（Gao et al., 2005）。补充材料图S8比较了分别以甲酸水和水为流动相时分析物的响应强度。研究结果表明，与纯水相比，使用甲酸水作为流动相可以获得更好的分析物响应。
MS 2扫描模式表明，所有分析物和内标的电离在正离子模式下的相对强度均远高于负离子模式。接下来，通过生产模式优化了包括碰撞能量（CE）、去簇电压（DP）和碎裂器在内的质谱参数。优化结果如表1所示。
表 1.五种分析物和内标的优化 MRM 参数。
3.2方法验证3.2.1 .特异性、线性度
图2显示了空白血浆、添加工作溶液的空白血浆样品以及WEA组大鼠口服给药后血浆样品的MRM色谱图。ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ、CA和IS的保留时间分别约为4.36、3.79、3.61、3.62、4.85和3.78 min。分析物和IS分离良好，血浆中的内源性物质不干扰待测成分的测定。
图 2.空白血浆 (A) 的代表性 UHPLC-ESI-MS/MS 色谱图；添加工作溶液 (500 ng/mL) 的空白血浆 (B)；口服 WEA 后的血浆样品 (C) 的代表性 UHPLC-ESI-MS/MS 色谱图。
表2总结了所有分析物的校准曲线和定量下限（LLOQ）。所有校准曲线均表现出良好的线性，相关系数（r² ）在0.9962至0.9996范围内。这些定量下限适用于药代动力学研究中分析物的定量检测。
3.2.2精密度和准确度
表3列出了质控样品的日内和日间精密度和准确度。日内精密度（RSD）范围为2.27%至13.42%，准确度（RE）范围为-12.81%至10.45%。日间精密度（RSD）范围为3.48%至11.23%，准确度（RE）范围为-6.50%至3.57%。所有日间和日内精密度和准确度均符合生物介质实验的要求。
3.2.3 .恢复和基质效应
如表 4所示，三种浓度下五种分析物的提取回收率（97.36% – 107.33%）和基质效应（88.28% – 104.41%）均在可接受的范围内。
3.2.4稳定性
稳定性实验结果表明，未发生明显的降解，结果汇总于表4。数据表明，大鼠血浆中的所有分析物在−80 °C下储存30天、经历三次冻融循环以及在室温下放置24小时后均保持稳定。
3.3药代动力学研究和生物转化分析
上述经验证的UHPLC-ESI-MS/MS方法成功应用于测定大鼠口服等摩尔剂量（1.5 mM）的ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ和CA以及1.22 mM WEA（由ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ的总和计算得出）后血浆中五种分析物的浓度。图3展示了分析物的平均血浆浓度-时间曲线。表5列出了大鼠口服ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ、CA和WEA后，分析物原型及其代谢物的平均血浆浓度。表6列出了药代动力学参数。
图 3.口服1.5 mM ASⅠ、(B) 1.5 mM ASⅡ、(C) 1.5 mM ASⅢ、(D) 1.5 mM ASⅣ、(E) 1.5 mM CA 和 (F) 1.22 mM ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ 总浓度后，原型化合物及其代谢物的平均血浆浓度-时间曲线（WEA 中）。（Met. 代表代谢物）。
图3和表5、表6的对比分析表明，大鼠口服ASI、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ、CA和WEA后，各处理组均出现不同程度的代谢转化，转化为CA，且各组转化率和转化效率存在显著差异。根据黄芪甲苷的结构复杂性，从最简单的分子构型到最复杂的分子构型，系统地研究了其药代动力学参数和生物转化特征。
图3A展示了大鼠直接口服1.5 mM CA后的平均血浆浓度-时间曲线。药代动力学参数包括AUC(0-t)为984.09 μg/L·h，Cmax为308.59 ng/mL，Tmax为1.00 h，t1/2Ke为1.86 h，t1/2KaTmax、t1/2Ke和t1/2Ka最短，AUC(0-t)Cmax最高。CA作为黄芪甲苷的常见苷元，具有低分子量和高渗透性，能够迅速被吸收进入体循环。这些结果证实 CA 是一种具有高口服生物利用度的生物活性成分。
图3E显示了大鼠口服1.5 mM ASⅣ后的血浆浓度-时间曲线，表明ASⅣ和CA均存在于体循环中。ASⅣ的血浆浓度-时间曲线呈现双相吸收特征，提示可能存在肠肝循环。ASⅣ最早在0.083 h即可检测到，而CA在1 h后出现，表明ASⅣ代谢产生的CA进入体循环至少需要1 h。 ASⅣ及其代谢物CA的药代动力学参数如下：AUC(0-t)值分别为166.71和464.18 μg/L·h，Cmax分别为39.42和44.20 ng/mL，Tmax分别为2.67和8.00 h，t1/2Ke分别为5.89和3.48 h，t1/2Ka分别为0.53和1.44 h，Ka分别为2.20和0.64 L/h，Ke分别为0.28和0.24 L/h。结果表明，ASⅣ代谢产物CA的吸收和消除速率低于母体化合物ASⅣ，但AUC(0-t)和Cmax值ASⅣ，提示口服给药后ASⅣ可能主要通过在体循环中大量转化为CA发挥其药理作用。在ASⅣ处理组中，代谢产物CA在给药后8小时CmaxTmax比CA处理组延长了8倍。这种Tmax的延长表明ASⅣ在胃肠道内的转化缓慢，提示其代谢转化需要更长的时间。据推测，ASⅣ的逐渐水解使得部分母体化合物能够进入体循环。此外，在等摩尔剂量下，ASⅣ代谢产生的CA的平均血浆浓度和AUC(0-t)均显著低于CA处理组，表明与直接给予CA相比，ASⅣ的生物利用度降低。
图3C显示了大鼠口服1.5 mM ASⅡ后，母体化合物ASⅡ及其代谢物ASIV和CA的血浆浓度-时间曲线。血浆浓度-时间曲线显示，ASⅡ及其代谢物ASIV均维持在较低的血浆浓度水平，并呈现多峰模式，提示可能存在肠肝循环或多个肠道吸收位点。与ASIV组类似，母体化合物ASⅡ最早在0.083 h即可在大鼠血浆中检测到，代谢物ASIV在0.25 h出现，而代谢物CA则在1 h后才被检测到。由于ASⅡ给药组中ASⅣ的血浆样本数据有限，因此无法对ASⅣ进行可靠的药代动力学分析。大鼠口服1.5 mM ASⅡ后，ASⅡ和CA的药代动力学参数如下：AUC(0-t)值分别为34.67和250.92 μg/L·h，Cmax值分别为16.64和20.58 ng/mL，Tmax值分别为1.17和8.67 h，t1/2Ke分别为2.73和6.06 h，t1/2Ka值分别为0.04和1.90 h，Ka值分别为23.54和0.76 1/h，Ke值分别为0.16和0.14 1/h。代谢物CA的AUC(0-t)和Cmax值均高于母体化合物ASⅡ和代谢物ASⅣ。这证实ASⅣ可能主要作为中间体发挥作用，或者只有极少量的ASⅡ转化为ASⅣ。根据代谢物在血浆中出现的时间推断CA的生成途径：与ASⅣ相比，ASⅡ在C-3木糖位点多了一个乙酰基。口服ASⅡ后，体内生成ASⅣ。随后，ASⅣ进一步水解，去除糖基，生成CA。同时，部分ASⅡ可能直接失去木糖基，生成中间体Bra B，后者随后失去葡萄糖基，生成CA。通过这种转化产生的CA进入体循环，是ASⅡ发挥药理作用的主要途径。ASⅡ和ASⅣ给药组的代谢谱和药代动力学特征高度相似。然而，ASⅡ组的母体化合物吸收和消除速率均低于ASⅣ组，表明ASⅡ在胃肠道内水解和转化为CA的过程较为缓慢，涉及多个转化步骤。在等摩尔给药条件下，ASⅡ 组中代谢生成的 CA 的平均血浆浓度和 AUC(0-t)不仅低于 ASⅣ 组，而且明显低于 CA 组。
图3B显示了大鼠口服1.5 mM ASⅠ后，母体化合物ASⅠ及其代谢物ASⅡ、ASⅣ和CA的血浆浓度-时间曲线。值得注意的是，在ASⅠ给药组的任何血清样本中均未检测到母体化合物ASⅠ或ASⅡ，表明口服给药后ASⅠ可能发生快速转化或具有较高的转化效率。ASⅣ仅在12小时采样点可定量，数据不足以计算其药代动力学参数。CA在1小时内即可检测到，其Cmax为43.73 ng/mL，Tmax为11.33 h，AUC(0-t)为600.08 μg/L·h，t1/2Ke为3.71 h，t1/2Ka为3.39 h，Ka为0.22 1/h，Ke为0.18 1/h。与ASⅡ和ASⅣ给药组相比，ASⅠ代谢产生的CA在相似的时间点出现在血浆中。其Cmax显著高于ASⅡ组，其AUC(0-t)也显著高于ASⅡ和ASⅣ组。吸收和消除所需时间较长，表明血清样本中未检测到ASⅠ和ASⅡ母体化合物更可能是由于ASⅠ的高转化率所致。ASⅣ可能是体内转化过程中产生的中间代谢物，也可能是ASⅠ代谢为ASⅣ的极小部分。ASⅠ给药后，CA仍然是血浆中检测到的主要代谢物。
与ASⅣ相比，ASⅠ的化学结构中C-3木糖部分多出两个乙酰基。因此，口服ASⅠ后，体内会发生脱乙酰化反应生成ASⅡ和ASⅣ。ASⅣ进一步水解去除糖基，生成CA（Wen等，2008）。另一种可能是，ASⅠ直接失去木糖部分形成中间体Bra B，Bra B随后失去葡萄糖部分生成CA。Zhou等（2012）发现，在ASⅣ于胃肠道转化为CA的过程中，C-3木糖基团的去除速度快于C-6葡萄糖基团，其中C-6葡萄糖基团的去除是限速步骤。与ASII和ASIV给药组相比，ASI可能由于其C-3木糖残基上的两个乙酰基而增加空间位阻，从而抑制脱乙酰化并直接去除木糖形成Bra B中间体，最终导致CA生成效率更高。这也解释了为什么ASⅠ代谢产生的CA在与ASⅡ和ASⅣ组相似的时间点出现在血浆中，但转化率更高。
图3D显示了大鼠口服1.5 mM ASⅢ后，母体化合物ASⅢ及其代谢物CA的平均血浆浓度-时间曲线（ASⅢ具有C-3二糖结构，不含C-6葡萄糖基，不会转化为ASⅣ）。在ASⅢ给药组的所有样本中均未检测到母体化合物ASⅢ。其代谢物CA的药代动力学参数如下：AUC(0-t)为1032.90 μg/L·h，Cmax为100.09 ng/mL，Tmax为6.67 h，t1/2Ke为2.92 h，t1/2Ka为1.74 h，Ka为0.49 1/h，Ke为0.26 1/h。与ASⅠ、ASⅡ和ASⅣ给药组相比，ASⅢ的转化关系更为简单。该组不仅获得了与CA给药组相当的AUC(0-t)，而且与ASⅠ、ASⅡ和ASⅣ组相比，其Cmax显著更高，Tmax、t1/2Ke和t1/2Ka更短。尽管ASⅢ和ASⅣ是异构体，但糖苷键的位置异构导致口服给药后药代动力学存在如此显著的差异。这些结果进一步支持了C-3取代基影响ASⅠ组代谢转化的假设。在等摩尔剂量下，ASⅢ组表现出极高的CA转化效率和更快的转化速率。
图3F显示了大鼠口服1.22 mM总浓度的ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ（溶于WEA溶液中）后体内ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ和CA的暴露情况。在ASⅢ给药组中，浓度高达1.5 mM的ASⅢ被有效转化为CA。血浆样本中未检测到ASⅢ母体化合物。因此，在仅含有0.12 mM ASⅢ的WEA给药组中检测到的对应于785.5/143.2离子对的峰可以推断来源于ASⅣ。
实验结果表明，在WEA给药组采集的血浆样本中未检测到ASⅠ和ASⅢ原型。虽然在样本中检测到痕量的ASⅡ和ASⅣ，但ASⅡ的数据不足以进行药代动力学参数计算。ASⅣ和CA的药代动力学参数分别为：AUC (0-t)值分别为47.35和173.49 μg/L·h，Cmax值分别为19.13和21.96 ng/mL，Tmax值分别为5.33和9.33 h，t1 /2Ke值分别为24.52和42.09 h，t1 /2Ka值分别为18.97和13.34 h，Ka值分别为2.87和0.90 1/h，Ke值分别为0.77和0.06 1/h。 WEA 给药组不含 CA，但血浆中 CA 的平均浓度最高，证实 CA 是由其他黄芪甲苷通过体内生物转化而形成的衍生物，并且其吸收和消除速度很慢。
ASⅣ既是WEA中的原型化合物，也是ASⅠ和ASⅡ转化而来的潜在代谢产物。因此，其药代动力学行为无法准确测定。本研究只能通过结合ASⅣ组和WEA治疗组的血浆ASⅣ浓度和药代动力学参数，推断WEA组中ASⅣ的吸收和转化情况。基于WEA组中ASⅣ的含量，利用ASⅣ给药组中ASⅣ的AUC (0-t)和Cmax值进行粗略转换，结果表明WEA组中由ASⅣ母体化合物贡献的ASⅣ的AUC (0-t)和Cmax值分别约为27.79 μg/L·h和6.57 ng/mL，显著低于ASⅣ的实测值。这表明WEA组中含有ASⅣ代谢产物，这些代谢产物是通过ASⅠ和ASⅡ的大量代谢转化而来的。 WEA中ASⅡ的浓度最高，因此WEA给药组在转化为CA时的药代动力学行为，如AUC (0-∞)和Cmax，与ASⅡ给药组非常相似。基于上述实验结果，推断ASⅠ和ASⅢ给药组中的ASⅠ和ASⅢ能够被高效快速地代谢生成CA。然而，WEA给药涉及多种化合物的联合吸收和药理作用，因此难以完全复制单化合物组中观察到的转化结果。此外，WEA中较高浓度的ASⅡ和ASⅣ的存在，值得进一步研究其涉及的具体化学反应、转化关系和转化效率。
图4展示了ASI、ASⅡ、ASⅢ、ASIV和WEA组与CA组数据比较所得的典型药代动力学参数比值。CA组的Cmax和Tmax值表明CA吸收迅速且生物利用度高，提示该化合物可能是黄芪甲苷发挥药理作用的活性代谢物。ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ组的比较分析揭示了以下规律：基于Cmax ： ASⅢ > ASⅠ > ASⅣ > ASⅡ；基于AUC (0-t)：ASⅢ > ASⅠ > ASⅣ > ASⅡ；基于Tmax ： ASⅢ > ASⅣ > ASⅡ > ASⅠ。这些结果表明，ASⅢ转化为CA的转化率最高，其次是ASⅠ。Tmax的排序进一步表明ASⅢ的代谢转化速度也最快。值得注意的是，ASⅠ不仅能快速转化为CA，而且还能保持较长时间的转化活性。在所有评估参数中，WEA 组的转化动力学和效率与 ASⅡ 组相似。
图 4. ASI 、ASⅡ、ASⅢ、ASIV 和 WEA 组相对于 CA 组的药代动力学参数 AUC (0-t) (A)、T max (B) 和 C max (C) 比率。
与已有的黄芪甲苷药代动力学研究相比，本实验结果首先证实，等摩尔剂量口服给药后，黄芪甲苷（包括ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ）在体内可大量转化为CA。ASⅣ仅是该转化过程中的少量中间体。CA的AUC (0-∞)和Cmax值显著高于其他黄芪甲苷，提示其可能是体内发挥药理作用的主要活性成分。其次，ASⅠ和ASⅢ给药组的CA水平高于ASⅡ和ASⅣ给药组，这一实验观察结果挑战了ASⅣ是治疗功效核心成分的观点。
在等摩尔剂量下，ASⅡ和ASⅣ的转化效率显著低于ASⅠ和ASⅢ组。ASⅢ具有C-3二糖结构，不含C-6葡萄糖基；ASⅠ在C-3木糖基的C-2″和C-3″位均含有乙酰基，而ASⅡ仅在C-2″位被乙酰化。从电子角度来看，ASⅠ中两个相邻的乙酰基可能导致羰基（C=O）的轻微共轭或极化，从而略微增加羰基氧上的负电荷密度。然而，这种电子效应相对较弱，对分子稳定性几乎没有实际影响。空间位阻和构象分析表明，ASⅠ的双乙酰化结构限制了糖链的柔性，增加了空间位阻，从而降低了其对水解或酶促反应的敏感性。这种双重乙酰基保护增强了ASⅠ的稳定性。相比之下，单乙酰化的ASⅡ由于空间位阻减小，结构暴露程度更高，更容易受到亲核攻击。化学微环境分析表明，ASⅠ的二乙酰化结构缺乏氢键供体，疏水性更强，这可能阻碍水分子接近。此外，二乙酰化构型的过渡态能量更高，有助于增强结构稳定性。ASⅠ的二乙酰化降低了木糖的柔性，这种构象可能与糖苷酶的活性中心相匹配，从而在脱乙酰化生成ASⅡ和ASⅣ之前，快速将木糖基化转化为Bra B单糖苷中间体，使ASⅠ能够更有效地转化为CA。
最后，图5展示了各种黄芪甲苷在体内的预测代谢转化途径。图中蓝色区域（图5A）代表原型黄芪甲苷化合物，黄色区域（图5B）代表转化过程中的关键中间产物，粉色区域（图5C）代表快速吸收并进入体循环的代谢物。蓝色实线表示本研究预测的最佳转化途径，绿色虚线表示可能同时发生的其他代谢途径。
图 5.预测黄芪甲苷在体内的转化途径。
值得注意的是，本研究采用等摩尔剂量法，在体内考察并比较了不同黄芪甲苷成分转化为CA的速率和程度。同时，本研究还考察并比较了WEA给药后母体化合物及其代谢产物CA的暴露特征。尽管WEA中ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ的总含量仅为1.22 mM，但黄芪甲苷（AR）中所含皂苷不仅限于这四种类型，还包括其他皂苷（Peng et al., 2023）。因此，可以推断WEA中皂苷的总剂量可能达到甚至超过1.5 mM，从而能够与单皂苷给药组进行比较分析。
3.4 .基于Q标记选择策略的黄芪甲苷含量测定
为了确定AR中黄芪甲苷的原始含量，并根据中药质量指标选择中的可测性原则，对不同批次的AR样品进行了含量测定。同时，采用新建立的方法（NeM）（Jiang等，2026）和《中华人民共和国药典》（ChP）中黄芪甲苷Ⅳ的样品制备方法（药典委员会，2025）对样品进行同步制备。
本研究成功应用NeM方法定量分析了22批AR样品中ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ的含量。样品信息见补充材料表S1。方法详情和含量测定结果见补充材料。采用NeM方法测定ASI、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ的含量结果见补充材料表S2和图6。ASI、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ含量之间的Pearson相关性分析结果见补充材料表S3。采用ChP方法测定ASⅣ和芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量结果见补充材料表S4。定量分析表明，不同种植年份和产地AR样品中黄芪甲苷的含量顺序一致为：ASⅠ > ASⅡ > ASⅣ ≥ ASⅢ。值得注意的是，ASⅠ是AR药材中含量最高的黄芪甲苷，显著高于其他黄芪甲苷。结合药代动力学研究结果，虽然黄芪甲苷（ASI）、黄芪甲苷Ⅱ、黄芪甲苷Ⅲ和黄芪甲苷Ⅳ均可转化为黄芪甲苷（CA），但它们的转化率和转化效率各不相同，其发挥药理作用的途径相似。NeM法能够同时测定多种黄芪甲苷，因此ASI、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ可作为多种质量指标，用于评价黄芪甲苷的质量。
图 6.采用NeM 方法测定 ASI、ASⅡ、ASⅢ 和 ASⅣ 的含量结果。
分别采用NeM法和ChP法的色谱条件测定ChP法制备的样品中的含量。含量测定结果如图7所示，相关性分析结果如图8所示。
图 7. ChP和 NeM 方法的含量测定结果。
图 8. NeM方法和 ChP 方法所得含量测定结果的相关性分析。
相关性分析结果（图 8）表明，对于使用 ChP 方法制备的样品，ChP 和 NeM 方法得到的结果一致，进一步证明了 NeM 方法的准确性和实用性。
【Citation】:Jiang H, Liu W, Zheng L, et al. Discrimination of the significance of astragalosides in Astragalus radix based on the in vivo exposure levels and pharmacokinetic characteristics of prototype saponins and their metabolites: A strategy for discovering and confirming quality markers[J].Journal of Ethnopharmacology,2026: 121415.
【贡献】★★★★★
本药代动力学研究首次系统地评价和比较了体内黄芪甲苷（ASI）、黄芪甲苷（ASⅡ）、黄芪甲苷（ASⅢ）和黄芪甲苷（ASⅣ）代谢转化为黄芪甲苷（CA）的速率和效率。值得注意的是，与黄芪甲苷（ASⅣ）和黄芪甲苷（ASⅡ）相比，黄芪甲苷（ASⅢ）表现出更优异的转化动力学和转化效率。WEA组的药代动力学行为值得进一步研究。含量测定结果表明，AR样品中黄芪甲苷的含量顺序为：ASⅠ > ASⅡ > ASⅣ ≥ ASⅢ。由于ChP方法采用ASⅣ作为AR的Q标记物，因此需要添加氨水将ASⅠ和ASⅡ转化为ASⅣ。这种方法既复杂又违背了环境可持续性原则。相比之下，NeM方法则简便、快速且准确。
本研究表明，ASI、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ均满足中药质量指标选择五项标准中的功效和可测量性原则，因此ASI、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ可作为评价AR质量的多个质量指标。
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