裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）作为一类产油真菌，其细胞中油脂含量可达细胞干质量的50%～70%，二十二碳六烯酸（DHA）更是可占到总脂肪酸的35%～55%，因此，作为生产油脂的工程潜力菌株，其脂质代谢调控的相关途径一直是被深入研究的热点。目前研究最多和较为认可的裂殖壶菌中油脂合成途径主要涉及2 种：合成饱和脂肪酸（SFAs）的需氧脂肪酸合酶（FAS）途径和合成多不饱和脂肪酸（PUFAs）的厌氧聚酮合酶（PKS）途径，但是其明确的调控机制尚未完全清晰，因此，需要从油脂合成调控的不同维度进行深入分析。
有研究表明，脂肪酸在裂殖壶菌中的存在方式分为2 种：游离形式的脂肪酸占极少部分，大多数是通过酯化反应装配到磷脂和甘油三酯（TAG）上进行积累与储存。Liu Ying等对Aurantiochytrium sp.PKU#SW7和Thraustochytriidae sp. PKU#Mn16发酵生产DHA的脂质谱图进行分析，发现DHA主要分布在中性脂质TAG中。裂殖壶菌中DHA尽管是以TAG的形式存在，但其合成后迁移到TAG的过程与磷脂的代谢密切相关。裂殖壶菌中磷脂可以通过Kennedy途径进行从头合成（图1），包含CDP-X磷脂合成途径和CDP-甘油二酯（DAG）磷脂合成途径；此外，磷脂还能经由酰基化途径直接合成。以磷脂中极为常见的磷脂酰胆碱（PC），其可通过3-磷酸胆碱-甘油（GPC）历经两步酰基化反应得到。并且磷脂之间的转化也很常见：PC可以通过磷脂酰乙醇胺（PE）转甲基反应生成，PC也能够转化为溶血磷脂酰胆碱（LPC），磷脂酰丝氨酸（PS）与PC和PE之间也可以相互转化。TAG的合成除了经由Kennedy途径，即通过二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）对DAG的sn-3位点进行酰化获得，还可以通过磷脂二酰甘油酰基转移酶（PDAT）和PC:二酰甘油胆碱磷酸转移酶（PDCT）催化的PC代谢通路进行合成。推测TAG中DHA的形成主要经PC通路迁移转化。由此可见，调控磷脂代谢会明显影响裂殖壶菌的脂质合成，这有利于阐明裂殖壶菌的油脂尤其是PUFAs的代谢调控机制。
磷脂是细胞膜的主要成分，影响细胞膜的流动性和通透性，磷脂的不同类型主要取决于其连接的疏水性脂肪酰基链和亲水性磷酸极性基团特性。PLD的转磷脂酰化活性和水解活性在TAG和磷脂的代谢转化中具有重要作用。已有研究表明PLD对植物细胞的生长和油脂合成都会产生影响。Lee等通过RNA干扰的方式将大豆中PLDα的表达水平下调，结果显示PC和PE中PUFAs的占比增加，但TAG的不饱和度降低，意味着PLDα的抑制减缓了磷脂向TAG的转化。Yang Wenyu等在亚麻荠中将2 个拟南芥磷脂酶D基因（AtPLDζ1和AtPLDζ2）进行了共表达，同时利用14C标记的甘油和乙酸酯探究其油脂的组装动力学，结果显示新合成的脂肪酸优先掺入到PC的sn-2位上，随后TAG含量增加，PC脂肪酸含量降低，这表明PLD会使磷脂与甘油酯之间发生转化。Bai Yang等在拟南芥中过表达了GmPLDγ基因以改变其甘油酯的代谢，GmPLDγ的表达会水解PC，使PC发生转化，从而促进了含有不饱和长链脂肪酸种子油的生产，增加产油量的同时也改变了油脂组成。目前微生物中关于PLD对油脂合成的影响研究甚少。Zhang Yiting等挖掘到了裂殖壶菌中PLD蛋白相关的2 个基因片段PLD1和PLD2，二者的调控对裂殖壶菌的代谢产生了不同的影响：PLD1基因的敲除对生物量和油脂产量影响不明显，但提高了油脂中PUFAs的占比，其中DHA占比提高了13.3%；PLD2基因敲除后生物量降低了32.8%，油脂产量降低了17.6%，脂肪酸组成变化不大。这是由于二者的转磷脂酰和水解活性偏好不同，PLD1的敲除加强了裂殖壶菌的磷脂合成通路，对磷脂的成分有一定影响，降低了PC占比，而提高了LPC和磷脂酰肌醇（PI）占比，有利于DHA与磷脂的装配，从而提高DHA的积累。以上结果表明，通过PLD调控磷脂的代谢能有效影响油脂的合成。
相比其他来源的PLD，链霉菌来源的PLD具有较高的转磷脂酰活性。因此，厦门大学化学化工学院的童俊、凌雪萍*、三峡公共检验检测中心的陆涛选择将抗生链霉菌（Streptomyces antibioticus）来源的PLD基因（SaPLD）过表达于裂殖壶菌中，考察过表达PLD对裂殖壶菌细胞生长和油脂合成的影响。基于细胞膜形态分析PLD对细胞生长的影响，结合磷脂组学和实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）分析PLD过表达对脂肪酸、磷脂与TAG的代谢影响，进而探讨PLD对裂殖壶菌的生长和油脂合成的代谢调控机制。
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SaPLD的密码子优化及过表达菌株的筛选
为实现链霉菌来源的SaPLD基因（GenBank登录号：D16444.1）在裂殖壶菌SR21中的高效表达，本实验依据裂殖壶菌的密码子偏好性，在保持氨基酸序列不变的前提下，对SaPLD基因的密码子进行优化设计，获得长度为1 527 bp的优化序列。优化后的SaPLD基因由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并定向插入至pUCSP载体质粒中，同时在基因两端分别引入Xba I和Nhe I限制性内切酶识别位点。利用Xba I和Nhe I对重组质粒pUC-SP-SaPLD进行双酶切鉴定（图2A），回收目的基因片段后，将其连接至实验室前期构建的pBluzeo-18S过表达载体，成功构建pBluzeo-SaPLD-18S重组表达载体（图2B）。随后，将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，利用含氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选（图3A）。挑取单菌落进行液体培养，提取质粒并进行PCR验证（图3B）。结果显示，阳性克隆菌株能够特异性扩增出SaPLD基因片段，初步证实目的基因已成功整合至pBluzeo-18S载体中。最后，委托厦门铂瑞生物科技有限公司对阳性克隆进行Sanger测序分析，测序结果进一步确认了pBluzeo-SaPLD-18S过表达载体的成功构建。
对成功构建的pBluzeo- SaPLD -18S过表达载体质粒实施PCR扩增，获取包含18S上下游同源臂、博来霉素抗性表达框及 SaPLD 表达框的线性化DNA片段。采用电转化技术，将该目的片段导入裂殖壶菌。以野生型裂殖壶菌菌株作为阴性对照，利用含博来霉素的抗性平板筛选电转化后的菌株，成功分离获得阳性转化子（图4A）。设计针对博来霉素抗性基因的特异性引物（扩增片段长度375 bp），分别对野生型菌株和转化菌株的基因组DNA进行PCR检测，并以pBluzeo- SaPLD -18S过表达载体质粒作为阳性对照。如图4B所示，野生型菌株基因组未扩增出抗性基因条带，而阳性转化菌株则呈现出预期的375 bp特异性条带。结果表明， SaPLD 基因已成功整合至裂殖壶菌基因组中，证实 SaPLD 过表达菌株构建成功。
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SaPLD过表达对裂殖壶菌及油脂积累的影响
如图5A所示，野生型菌株在48 h开始进入指数生长期，48～96 h期间生物量和油脂产量快速增长和积累，而后进入稳定期，油脂产量最高达到24.9 g/L。SaPLD过表达菌株在前72 h与野生型生长基本一致，72 h后生长变缓，比野生型延迟24 h进入稳定期，最终生物量比野生型低7.9%。2 株菌的总油产量一直在逐步积累，96 h前过表达菌株低于野生型，但后期过表达菌株总油产量持续增加最终超过野生型，最高总油产量达到25.9 g/L，比野生型提高了4.0%。
由图5B可知， SaPLD 过表达菌株的葡萄糖消耗速率更快，在96 h就基本耗尽；而野生型菌株在48 h前葡萄糖消耗速率较慢，生长相对较慢（48 h时生物量略低于过表达菌株），随后糖消耗开始加快，在120 h耗完所有葡萄糖。尽管突变株的糖消耗较快，但并没有体现在生物量的增加上，而相对是糖消耗较慢的野生型生长更佳，这说明 SaPLD 改变了细胞糖代谢的利用途径。由图5C可知，2 株菌的油脂占比均随着细胞的生长而增加，前期野生型的油脂占比高于突变株，后期突变株高于野生型，可以看出 SaPLD 过表达最终提高了裂殖壶菌的油脂占比，最高值比野生菌株提高了13.5%，这说明 SaPLD 可以提高裂殖壶菌中单位细胞合成油脂的能力。更为重要的是，从48～72 h野生型的油脂占比提高了14.0%，而突变株提高了40.1%，结合葡萄糖的消耗速率和生物量的变化，可以看出 SaPLD 的过表达使得更多的碳源进入脂质合成途径，从而最终提高了突变株的油脂含量。
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SaPLD过表达对细胞形态的影响
发酵培养过程中观察到SaPLD过表达细胞在72 h出现破裂，取样离心后上清液浑浊，漂浮着破碎的细胞，这说明SaPLD对宿主裂殖壶菌产生了一定程度的毒害作用。如图6所示，野生型菌株细胞表面光滑，形态饱满完整，而SaPLD过表达菌株细胞表面出现了皱缩、破裂的情况，细胞整体尺寸也略小于野生型细胞。这表明突变株细胞膜在SaPLD作用下功能受到影响，细胞无法正常生长繁殖。Mishima等发现当重组的PLD表达质粒转入宿主细胞进入诱导阶段时，在PLD的毒性作用下几乎所有的重组细胞都被迅速杀死，活细胞数从109以上急剧减少至103，显示出PLD极强的细胞毒性。张莹在大肠杆菌表达链霉菌PLD时发现其对宿主的生长产生了明显的毒害作用，影响了大肠杆菌BL21的生长速率，菌体浓度始终低于对照组。这表明PLD的过表达对宿主细胞会产生一定的毒害作用。
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NaCl胁迫对SaPLD过表达菌株生长和细胞形态的影响
PLD对宿主细胞产生毒性与其引起细胞离子稳态失衡及其磷脂代谢异常变化有关，而有学者认为盐胁迫作用可以缓解PLD对大肠杆菌的毒性，一定程度上可以抑制细胞发生裂解。本课题组前期研究发现在大肠杆菌进行PLD表达时，NaCl胁迫作用下大肠杆菌的生物量有所增加，这表明NaCl胁迫作用为大肠杆菌提供了某种保护，有助于细胞抵抗PLD产生的毒性，因此选择钠离子对其进行胁迫研究。首先考察了不同浓度的NaCl对细胞生长和油脂合成的影响。如图7A所示，随着NaCl质量浓度的增加，SaPLD过表达菌株的总油产量有了进一步的提升，当NaCl质量浓度为12 g/L时，总油产量达到最高值（30.5 g/L），相比野生型菌株和未胁迫培养过表达菌株分别提高了27.3%和17.6%。在NaCl的胁迫作用下，SaPLD过表达菌株生物量也有所恢复，当NaCl质量浓度为12 g/L时，生物量恢复到了野生型裂殖壶菌的生长水平（图7B），这说明NaCl胁迫作用确实可以缓解PLD对裂殖壶菌的细胞膜毒性。裂殖壶菌作为海洋真菌，始终生存在盐度较高的环境下，PLD的表达可能打破了细胞内的离子平衡，而钠离子可以维持细胞内渗透压平衡和调节酸碱平衡，氯离子对嗜盐菌株的生长有着至关重要的作用，因此添加一定量的NaCl可以起到缓解PLD的细胞毒性、促进裂殖壶菌细胞生长的作用。
本实验进一步分析了在NaCl质量浓度为12 g/L时突变株的生长代谢情况。如图8A所示，胁迫培养菌株和未胁迫突变株在120 h前的生长趋势基本一致，SaPLD-NaCl组的生物量一直略低于SaPLD组，而在120 h后SaPLDNaCl组生物量继续增加，并在144 h超过SaPLD组，基本达到野生型菌株的生长水平；胁迫组的油脂产量也得到进一步提高。由图8B可知，在高浓度盐胁迫下，SaPLD过表达菌株的葡萄糖消耗速率在24 h后比SaPLD组慢，48 h后和野生型的糖消耗量基本一致，这也是SaPLDNaCl组的生物量在120 h前一直低于SaPLD组的原因，可能是渗透压的变化导致菌株细胞代谢发生了调整。72 h后SaPLD-NaCl组的糖消耗速率加快，在120 h时与其他2 组一样糖基本消耗完，SaPLD-NaCl组的生物量最终与野生型菌株一致。由图8C可知，野生型菌株的产油能力在72 h后基本趋于稳定，而SaPLD过表达菌株产油能力在96 h后高于野生株。由图8D可知，SaPLD过表达菌株的非油干基质量浓度在72 h后低于野生型菌株。综上，过表达细胞中更多代谢物用于油脂的合成，提高了单位细胞油脂的生产能力，且SaPLD-NaCl组的产油能力优于SaPLD组，这可能是由于盐胁迫改变了细胞膜的状态，促进了细胞的整体生长代谢，进而提高了油脂合成。
由图9可知，在盐胁迫下过表达菌株的细胞皱缩破裂现象有了明显缓解，细胞表面恢复光滑，形态饱满，细胞形状比未胁迫的SaPLD过表达菌株细胞更完整，尺寸也有所增加，基本和野生型形态一致。这表明NaCl胁迫培养可以改善SaPLD对细胞膜的毒害作用。从离子稳态的角度来看，盐胁迫下细胞需要重新平衡胞内离子浓度以维持正常生理功能。在植物研究中，已有诸多证据表明PLD参与离子转运调控过程。例如Zhang Ying等研究发现在盐胁迫下，转PePLDδ的拟南芥通过增加编码质膜Na+/H+反转运蛋白（AtSOS1）和H+-ATPase（AtAHA2）基因的转录，使得转基因植物能够更好地进行Na+外排并减少K+损失，维持细胞内的离子稳态。并且，在盐处理条件下抗氧化酶被激活，编码超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶的基因转录水平上调，从而降低了电解质泄漏量、丙二醛含量和H2O2水平，减轻氧化损伤。类似地，在裂殖壶菌中，盐胁迫可能激活PLD相关的离子转运调控通路。当环境中的盐浓度升高，裂殖壶菌可能通过调节细胞膜上离子通道或转运蛋白的活性与表达，促进Na+排出细胞，减少胞内Na+积累对细胞造成的毒性影响，同时维持K+等其他离子的正常浓度梯度，保障细胞内酶活性和代谢反应的正常进行。不仅如此，盐胁迫促使PLD参与激活抗氧化酶促系统，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶等。这些酶能够协同作用，将细胞内过多产生的活性氧，如超氧阴离子自由基、过氧化氢等转化为无害的水和氧气，降低活性氧对细胞大分子物质，如脂质、蛋白质和核酸的氧化损伤，进而缓解PLD过表达可能带来的细胞毒性。
综上所述，盐胁迫缓解PLD对裂殖壶菌细胞毒性的机制是多方面的，涉及离子稳态调节、抗氧化防御系统激活等。未来研究可借助转录组学、蛋白质组学、代谢组学等多组学技术，深入分析盐胁迫下裂殖壶菌细胞内的分子变化，进一步明确这些机制之间的相互关系与协同作用，为更好地理解和利用裂殖壶菌的生理特性提供理论依据。
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SAPLD过表达对二十碳五烯酸（EPA）和DHA合成的影响
由图10可知，改造菌中EPA的合成较野生型均有明显增加，且NaCl胁迫培养后，EPA的合成进一步提高。DHA合成呈现出相反的变化，突变株中DHA的产量和单位细胞内的含量均比野生型低，但胁迫培养的突变株还是略高于未胁迫培养的突变株。虽然EPA和DHA均是PUFAs，但却出现了不同的变化，这可能是两者的合成途径不同，需要进一步的分析研究。
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SaPLD过表达对总油脂中脂肪酸组成的影响
如表1所示，在摇瓶发酵过程中SaPLD过表达对脂肪酸组成成分产生了明显影响，其中SFAs相对含量提高（主要体现在C16:0的增加），PUFAs相对含量下降。与野生型菌株相比，在144 h时突变菌株的SFAs相对含量极显著提高（P＜0.01），PUFAs和DHA相对含量均极显著降低（P＜0.01），这说明SaPLD过表达不利于PUFAs的积累，尤其是DHA的合成。PUFAs的减少会对细胞膜结构产生不利的影响，从而影响裂殖壶菌对营养物质的利用，进而影响了细胞生长。但EPA呈现了相反的变化，SaPLD过表达增加了脂肪酸中EPA的占比，在144 h时EPA占比比野生型菌株提高了35.7%，图10也显示SaPLD过表达菌株的EPA产量和单位细胞内含量分别比野生型提高了约43%和约70%，进一步说明SaPLD过表达有利于EPA的合成。
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SaPLD过表达对磷脂代谢的影响
7.1 SaPLD过表达对磷脂合成的影响
如图11所示，SaPLD过表达后使得细胞磷脂整体合成减弱，TAG合成增强。3 株菌中TAG的相对含量在脂质转化期（120 h）均比脂质合成期（72 h）高，而磷脂相对含量则降低，表明裂殖壶菌在后期会将磷脂转化为TAG，从而提高TAG的产量。此外，在盐胁迫条件下突变株的磷脂通路在前期（72 h）会比未胁迫时略有恢复，这说明盐胁迫可能通过调控磷脂代谢改变细胞膜状态，进而促进细胞生长。
7.2 SaPLD过表达对磷脂中脂肪酸组成的影响
由表2可知，无论是在野生型还是过表达菌株中，TAG中SFAs含量最高，接近50%～60%，其中C16:0占比最高，接近SFAs的90%以上；大部分的DHA、DPA和EPA占总PUFAs含量的90%以上，表明PUFAs主要贮存在TAG中；从发酵时间来看，所有菌株在发酵后期的TAG中EPA和DHA含量均有增加，相应地SFAs出现了下降，表明发酵后期更多的PUFAs迁移积累在TAG中；从不同菌株来看，SaPLD过表达明显降低了发酵过程TAG中的DHA含量，相对地提高了SFAs含量和EPA含量，这说明SaPLD过表达抑制了TAG中DHA的结合，促进了SFAs和EPA的结合，也表明EPA和DHA的合成途径存在差异，EPA可能更多地与SFAs的合成途径有关。
磷脂中SFAs含量也接近40%～50%，但其中C 16:0 占比低于TAG，而C 18:0 占比明显提高，说明C 18:0 更偏向结合在磷脂中；磷脂中结合的其他脂肪酸接近30%～40%，而PUFAs仅占10%～15%，其中基本不含EPA，说明PUFAs主要结合在TAG中；从发酵时间来看，在120 h时所有菌株磷脂中DHA含量均低于72 h时，结合TAG中后期DHA含量的增加，推测后期DHA从磷脂向TAG中迁移贮存；而过表达菌株磷脂中SFAs含量和其他脂肪酸则呈现与野生型菌株不同的变化，后期磷脂中SFAs含量略微增加，PUFAs含量只有略微降低，表明SaPLD的过表达抑制了PUFAs从磷脂向TAG中的迁移，最终减少了DHA的积累；从不同菌株来看，对比野生型，过表达SaPLD在72 h时同时降低了磷脂中SFAs和DHA的占比，而在120 h同时提高了二者的占比，但前期对DHA的影响更为明显，后期对SFAs的影响更为明显，这说明SaPLD表达在前期抑制了磷脂结合脂肪酸的能力，主要抑制DHA的结合能力，在后期有利于脂肪酸结合到磷脂上，主要促进SFAs的结合。
另外，相比于未胁迫培养，盐胁迫培养并未对突变株中各脂肪酸含量有明显影响，进一步说明盐胁迫对脂肪酸的主要合成途径并未产生影响，主要是保护了细胞膜的形态，进而促进了细胞生长。值得注意的是，EPA主要结合在TAG中，在磷脂中只检测到了极其微量的EPA，表明EPA的积累更多地与TAG合成通路有关，与磷脂代谢相关性不大，这为开展裂殖壶菌产EPA的研究提供了新的视角。
7.3 SaPLD过表达对磷脂类型的影响
如图12所示，裂殖壶菌中磷脂种类丰富，野生型菌株与SaPLD过表达菌株中都检测出PC、PG、PI、PE、LPC、PS和PA这7大类磷脂，占比最高的主要为PC、PG和PI，其中PC含量占磷脂总量的一半左右。Wang Guang等也发现在裂殖壶菌中PC是主要的极性脂质。此外，菌株磷脂种类占比在发酵的不同时期均出现了变化，表明在对数生长期（72 h）和脂质转化期（120 h）磷脂的代谢会发生变化。
对于野生菌株而言，除了PG在120 h时明显降低之外，其他磷脂均有不同程度的增加。PG与细胞的生长状况有着密切的联系，在对数生长期发酵液中碳源充足，且葡萄糖转换为甘油比转化为其他磷脂极性头部基团要容易的多，所以在碳源充足的情况下合成PG可能更容易满足细胞指数生产期间的膜磷脂供应；在脂质转化期，葡萄糖消耗殆尽，细胞停止增殖，膜磷脂代谢从磷脂合成转向磷脂间的相互转化，PG合成降低，这又会影响细胞应激感应和适应机制的脂质依赖性。PI占比的增加可能是因为细胞中脂质代谢活跃，PI作为信号分子加强了相关代谢的调控。LPC占比的增加可能是因为细胞生长后期开始破裂，导致LPC的增加，这与Moog等发现LPC含量的增加会使细胞膜发生破裂，影响细胞生长的结果一致。该研究表明PE、PS和PA占比虽然很少，但它们组成的变化在细胞膜结构和功能中也发挥着重要作用。
对比野生型和过表达菌株的磷脂组成，在72 h时过表达菌株中PG和PC含量明显降低，而PI、LPC和PA均有一定程度的增加，PS和PE无明显变化。PLD能够催化水解反应和转磷脂酰反应，一方面SaPLD的过表达催化底物PC和PG发生水解反应，使二者含量降低，导致过表达菌株细胞生长开始低于野生型，而PC和PG的水解使得产物PA含量增加，PA经Kennedy途径合成TAG，这也是SaPLD过表达菌株油脂产量增加的原因之一；另一方面PLD的转磷脂酰活性使得不同磷脂之间发生了转换，PG转化为信号作用更强的PI进行信号传导和脂质调控。在发酵120 h时，过表达菌株中LPC和PA占比明显提高。LPC的增加可能是因为SaPLD过表达对宿主细胞产生毒性，从而使细胞膜结构发生了变化。PA的增加进一步说明有更多的磷脂发生水解，进而对应于PI和PG含量减少，从而增强了Kennedy途径代谢流，促进磷脂向TAG的转变。
对于过表达菌株而言，盐胁迫培养没有明显改变相同时间段下细胞的磷脂组成，这表明盐胁迫抵抗PLD的细胞毒性并非通过改变磷脂成分，而有可能是改变了胞内外的离子代谢流，从而调控了细胞膜功能，维护了细胞形态的完整性，这与2.7.2节的结论相印证。
7.4 SaPLD过表达对相关基因转录水平的影响
脂肪酸合成的第1步是通过乙酰辅酶A羧化酶（ACC）将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A，为脂肪酸和油脂积累提供前体物。如图13A所示，SaPLD的过表达使ACC转录水平在前期提高，而在发酵的中后期降低，结合图5A可知SaPLD过表达后使菌株在前期把更多的葡萄糖转化为脂质合成前体丙二酰辅酶A，从而促进中后期油脂的合成。Li Jing等发现在氮缺陷条件下Nannochloropsis中ACC的表达后期降低，但总脂质含量显著增加。链长因子（CLF）作为PKS基因簇上的延长因子，调控着超长链PUFAs的合成，现已证实PKS和FAS途径分别负责裂殖壶菌中DHA和SFAs的合成，故对脂肪酸合成途径相关的FAS和CLF进行转录水平分析。如图13B、C所示，SaPLD的过表达使菌株细胞中FAS基因转录水平上升，而CLF基因转录水平出现了下调，这与油脂中脂肪酸占比变化相印证（表1），SFAs含量增加，而DHA占比减少。磷脂酸磷酸酶（PAP）催化PA合成DAG，再由DGAT催化合成TAG。如图13D、E所示，过表达菌株中PAP和DGAT的转录水平均高于野生型，这说明SaPLD过表达使裂殖壶菌中Kennedy途径增强，产生更多的PA（图12）和DAG去合成TAG，最终提高油脂产量（图5）。PDAT和PDCT两种酶均可作用于PC将其分别转化转为TAG和DAG。Lu Chaofu等在拟南芥突变种子中发现，当PDCT突变时会导致DAG中的PUFAs含量显著降低。由图13F、G可知，在裂殖壶菌中过表达SaPLD使PDAT的转录水平降低，而PDCT的表达水平先增加后降低，这表明SaPLD的过表达削弱了PC通过PDAT催化直接将脂酰基转移至DAG形成TAG的通路，相应强化了水解其他磷脂生成PA和将PC经PDCT作用转化为DAG的通路，DAG再经DGAT催化合成TAG，最终使得TAG含量增加。
7.5 SaPLD过表达调控裂殖壶菌油脂代谢的机制分析
SaPLD过表达后使裂殖壶菌细胞生长和油脂代谢都发生了变化，其对脂质代谢的调控机制如图14所示。过表达的SaPLD更多地发挥水解作用，使得总磷脂含量降低，其中主要催化磷脂PC发生水解反应，使PC转化为PA，促进了PA经Kennedy途径形成DAG进而转化为TAG，最终使总油含量提高。由于PC的水解，使得主要通过结合PC再转移至TAG的DHA减少，游离的DHA会反馈抑制合成PUFAs的PKS通路，相应促进了合成SFAs的FAS通路，最终使得与PKS通路相关的DHA合成降低，与FAS通路相关的EPA合成增加。Liu Jin等在利用微拟球藻提升EPA产量的研究中发现，细胞内的代谢流会发生改变，使得参与SFAs合成的相关物质和能量供应也相应增加，以满足整体脂肪酸合成网络的需求，体现出EPA合成与SFAs合成之间存在正向关联。对脂肪酸合成途径的干预并非孤立地影响某一种脂肪酸的合成，而是对整个脂肪酸代谢网络产生系统性影响。这进一步支持了本研究的结论，即SaPLD过表达引发的代谢变化并非单一途径的改变，而是涉及多个脂肪酸合成途径之间的相互作用。当PKS通路受游离DHA反馈抑制而影响DHA合成时，与之相关联的FAS通路被促进，使得EPA合成增加的同时，SFAs合成途径也可能因整体代谢网络的调整而受到正向影响，最终表现出EPA与SFAs合成途径呈正相关。
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结 论
本研究通过对裂殖壶菌中异源过表达SaPLD的深入探究，系统揭示了PLD在调控细胞生长与油脂代谢过程中的复杂机制。SaPLD通过水解PC和PG，增强PA生成，激活Kennedy途径，最终实现油脂合成的上调。尽管SaPLD过表达对细胞生长具有一定毒性，但通过盐胁迫手段可有效缓解其负面影响，并进一步提升油脂产量。在脂肪酸代谢方面，SaPLD的引入改变了裂殖壶菌脂肪酸合成偏好，在降低DHA合成的同时，大幅促进了EPA的积累，这为裂殖壶菌作为EPA生产平台的开发提供了新方向。本研究不仅深化了对裂殖壶菌磷脂代谢与油脂合成调控机制的理解，更为工业菌株改造提供了重要的理论依据和技术策略。未来研究可在此基础上，深入解析SaPLD水解活性调控的分子机制，通过蛋白质工程手段对SaPLD进行定向改造，增强其在裂殖壶菌中的催化特异性与稳定性，减少对细胞生长的负面影响，为实现裂殖壶菌高效合成特定脂肪酸、满足食品、医药等领域的需求奠定坚实基础。
作者简介
第一作者：
童俊，厦门大学化学化工学院2024级硕士研究生，研究方向主要为功能油脂的微生物合成。
通信作者：
凌雪萍，厦门大学化工学院副教授，博士，研究领域：微生物代谢工程、酶工程与益生菌发酵工艺开发；先后主持和参与国家级、省部级等项目20余项，企业合作与开发项目15余项；发表国内外学术论文50余篇，获得国内外授权专利20余项。在微生物合成多不饱和脂肪酸领域研究多年，完成了从菌种进化改造、合成培养基及流加培养工艺优化、小试、中试到工业化生产的成套发酵和油脂提取、精制、包埋等集成化技术和工艺。其中DHA生产主要技术指标远超同类行业水平，已在厦门汇盛生物有限公司、厦门金达威集团等多家企业实现工业化生产，促进了相关行业的经济发展与产业布局。
引文格式：
童俊, 陆涛, 卢英华, 等. 异源表达磷脂酶D调控裂殖壶菌磷脂代谢对脂质合成的影响[J]. 食品科学, 2025, 46(22): 213-226. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250508-034.
TONG Jun, LU Tao, LU Yinghua, et al. Effect of heterologous expression of phospholipase D on lipid synthesis by regulating phospholipid metabolism in Schizochytrium sp.[J]. Food Science, 2025, 46(22): 213-226. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250508-034.
实习编辑：杨倩；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
为汇聚全球智慧共探产业变革方向，搭建跨学科、跨国界的协同创新平台，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）、中国食品杂志社《食品科学》杂志（EI收录）、中国食品杂志社《Food Science and Human Wellness》杂志（SCI收录）、中国食品杂志社《Journal of Future Foods》杂志（ESCI收录）主办，西南大学、 重庆市农业科学院、 重庆市农产品加工业技术创新联盟、重庆工商大学、 重庆三峡科技大学 、西华大学、成都大学、四川旅游学院、北京联合大学、 中国-匈牙利食品科学“一带一路”联合实验室（筹）、 普洱学院 共同主办 的“ 第三届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会 ”， 将于2026年4月25-26日 （4月24日全天报到） 在中国 重庆召开。
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为系统提升我国食品营养与安全的科技创新策源能力，加速科技成果向现实生产力转化，推动食品产业向绿色化、智能化、高端化转型升级，由北京食品科学研究院、中国食品杂志社《食品科学》杂志（EI收录）、中国食品杂志社《Food Science and Human Wellness》杂志（SCI收录）、中国食品杂志社《Journal of Future Foods》杂志（ESCI收录）主办，合肥工业大学、安徽农业大学、安徽省食品行业协会、安徽大学、合肥大学、合肥师范学院、北京工商大学、中国科技大学附属第一医院临床营养科、安徽粮食工程职业学院、安徽省农科院农产品加工研究所、安徽科技学院、皖西学院、黄山学院、滁州学院、蚌埠学院共同主办的“第六届食品科学与人类健康国际研讨会”，将于 2026年8月15-16日（8月14日全天报到）在中国 安徽 合肥召开。
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