超分子水凝胶凭借其可逆的非共价相互作用，在生物医学领域展现出巨大潜力，尤其是在组织工程和药物递送方面。然而，这类材料虽然具有刺激响应性和自愈合等动态特性，却常常面临力学性能较弱的挑战。为了扩展其应用范围，研究人员尝试引入第二层共价聚合物网络，构建杂化双网络水凝胶，从而显著提升材料的抗拉伸、抗压缩和抗断裂能力。然而，尽管这种策略在力学增强方面取得了进展，共价聚合物的加入如何影响超分子网络的精细纳米结构，长期以来仍是一个被忽视但至关重要的科学问题。特别是在高分子浓度升高时，拥挤效应和耗尽力可能诱导超分子纤维发生高阶组装，这一现象在凝胶相中尚未得到系统探索。
针对上述挑战，莱顿大学Roxanne E. Kieltyka教授课题组首次揭示了共价网络形成速率对杂化双网络水凝胶中超分子纤维结构的决定性作用。通过利用逆电子需求狄尔斯-阿尔德（IEDDA）反应的可调动力学特性，研究团队发现：缓慢的共价交联过程能够促使超分子纤维在耗尽作用下自组装成微米级纤维束，而快速的共价网络形成则会动力学锁定低纳米尺度的单根纤维结构。这种微观结构的差异最终导致缓慢形成的双网络水凝胶在压缩韧性上实现了近两倍的提升，为通过反应动力学调控软物质多尺度结构提供了全新思路。相关论文以“Covalent Network Formation Rate Controls Depletion-Induced Supramolecular Assembly in Hybrid Double Network Hydrogels”为题，发表在Angewandte Chemie International Edition上。
双网络水凝胶的设计理念
为直观展示这一创新策略，研究团队在示意图中呈现了超分子-共价双网络（SCDN）水凝胶的构建原理。图中展示了两种不同取代基的四嗪功能化PEG大单体（PEG-Tz1和PEG-Tz2），它们与PEG-降冰片烯（PEG-Nb）通过IEDDA点击反应形成共价网络。与此同时，基于方酰胺的三足两亲分子（SQ）自组装成超分子纤维网络。关键在于，共价网络的形成速率——无论是快速还是缓慢——决定了超分子纤维是保持分散状态还是组装成致密的纤维束，进而影响水凝胶在压缩载荷下的力学响应行为。
图1： 本工作中制备的超分子-共价双网络水凝胶示意图。(A) 末端功能化四嗪（C-6位带有不同取代基）的PEG大分子单体（PEG-Tz1和PEG-Tz2）通过逆电子需求Diels-Alder点击反应与PEG-降冰片烯（PEG-Nb）反应控制共价网络的形成速率。这些共价网络在基于方酰胺的三脚架两亲分子（SQ）存在下形成，后者自组装成超分子纤维，它们共同构成SCDN水凝胶。(B) SCDNs（蓝色网络）由不同速率形成的共价网络与超分子纤维（棕色网络）组成的概念性图示，以及耗竭诱导超分子组装对杂化双网络水凝胶压缩行为的影响。深红色纤维代表由棕色单根超分子纳米结构形成的超分子纤维束。
流变学揭示的双阶段凝胶化过程
通过振荡流变学测量，研究人员量化了不同四嗪取代基对网络形成速率的影响。实验结果显示，带有甲基取代基的PEG-Tz1与PEG-Nb反应较慢，在37°C下凝胶点约为30分钟（4 mM浓度），而氢取代的PEG-Tz2则反应迅速，凝胶点仅需约2分钟。当将超分子SQ纤维引入体系后，慢速体系表现出明显的双阶段凝胶化曲线：初期储能模量（G'）约100 Pa，对应SQ网络的初步形成；随后在3小时内逐渐上升至1-2 kPa，反映共价网络的逐步建立。相比之下，快速体系仅呈现单阶段凝胶化曲线，在60分钟内G'即达到4-5 kPa的平台值。值得注意的是，尽管两种体系的最终模量相近，但慢速体系在SQ浓度高于3 mM时出现了G'的轻微下降，暗示着结构的特殊演化。
图2： 使用不同电子特性四嗪的SCDN水凝胶的振荡流变学测量。含递增浓度SQ的水凝胶储能模量随时间变化，使用快速PEG-Tz2（A、B）或慢速PEG-Tz1（C、D）大分子单体制备。快速PEG-Tz2（B）和慢速PEG-Tz1（D）SCDNs中各种SQ浓度下的平台储能模量（实心条）和损耗模量（条纹条）值。时间扫描测量使用0.05%应变、1 Hz频率和37°C条件。平均值±标准差，n=3。
压缩力学性能的显著差异
单轴压缩测试进一步揭示了两种网络在力学性能上的巨大差异。慢速PEG-Tz1/Nb双网络水凝胶的应力-应变曲线显示，其断裂应力、断裂应变和韧性均显著优于快速PEG-Tz2/Nb体系。定量分析表明，慢速体系的韧性从快速体系的约7 kJ/m³提升至约15 kJ/m³，实现了超过两倍的增强。同时，断裂应力和断裂应变也相应提高。这一显著的压缩性能改善表明，慢速共价网络形成过程中，超分子纤维的束状结构能够更有效地传递载荷并耗散能量，从而赋予材料更高的抗压能力。
图3： 共价单网络和SCDN水凝胶的压缩流变学结果。(A) 单轴应力-应变曲线，(B) 韧性，(C) 断裂应力，(D) 断裂应变。浓度：SN：3 mM PEG-Tz1/Nb（慢速）或PEG-Tz2/Nb（快速），SCDN：4 mM SQ和3 mM PEG-Tz1/Nb（慢速）或PEG-Tz2/Nb（快速）。样品以10 μm/s的速度压缩。平均值±标准差，n=2。
冷冻电镜揭示的微观形貌差异
利用冷冻扫描电子显微镜（cryo-SEM），研究团队观察了单一共价网络和双网络水凝胶的微观形貌。结果显示，快速交联的PEG-Tz2/Nb单一网络呈现出较大的孔径，而慢速交联的PEG-Tz1/Nb网络则具有更小且更均匀的孔结构。当引入SQ超分子纤维后，这种微观结构差异基本得以保持。然而，由于共价网络与超分子纤维在形貌上难以区分，cryo-SEM无法直接可视化纤维束的形成，这促使研究人员转向更高分辨率的共聚焦显微镜技术。
图4： 单网络（左）和SCDN（右）水凝胶的冷冻扫描电镜成像（A-D）。快速PEG-Tz2/Nb（A、B）和慢速PEG-Tz1/Nb（C、D）的显微照片。(E) 基于冷冻扫描电镜图像计算的孔径参数。浓度：SN：3 mM PEG-Tz1/Nb或PEG-Tz2/Nb，SCDN：4 mM SQ和3 mM PEG-Tz1/Nb或PEG-Tz2/Nb。标尺：300 nm。
共聚焦显微镜实时追踪纤维束动态形成
为了实现超分子纤维的可视化，研究人员合成了荧光标记的SQ-Cy5单体（1 mol%），并将其与未标记的SQ共组装。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对双网络水凝胶进行长达3小时的实时成像，一个令人惊叹的动态过程得以揭示。在慢速交联的PEG-Tz1/Nb网络中，SQ纤维在3小时内逐渐增粗、伸长，最终形成直径达296 ± 40 nm、长度达数微米的致密纤维束。这一时间尺度与流变学中G'达到平台值的时间完美吻合。相反，在快速交联的PEG-Tz2/Nb网络中，SQ纤维始终保持均匀分散状态，即使监测长达一周也未观察到任何成束现象。这一鲜明对比表明，快速共价交联在超分子纤维发生侧向相互作用之前就将其动力学锁定，而慢速交联则为耗尽力驱动的纤维组装提供了充足的时间窗口。
图5： (A) 快速和慢速SCDN水凝胶制备流程示意图。(B) 快速（顶部）和慢速（底部）SCDN水凝胶（4 mM SQ和3 mM PEG-Tz1/Nb或PEG-Tz2/Nb）从t=0到3小时（每小时间隔）的代表性共聚焦成像时间序列。图像中调整了亮度和对比度。原始（未处理）显微照片见图S6。SQ水凝胶含有1 mol% SQ-Cy5。标尺：10 μm。
大分子拥挤剂诱导的纤维束形成
为了解耦共价交联反应与拥挤效应的贡献，研究人员分别将SQ纤维与PEG-Tz1、PEG-Tz2、PEG-Nb以及未修饰的PEG-OH和葡聚糖混合。令人惊讶的是，仅添加3 mM的PEG-Nb或PEG-OH即可诱导SQ纤维形成直径约300 nm的束状结构，而PEG-Tz1和PEG-Tz2则无法实现这一效果。动态光散射（DLS）分析揭示，四嗪功能化的PEG大单体在水溶液中倾向于自发聚集，导致其有效拥挤能力降低；而PEG-Nb和PEG-OH则保持较好的胶体稳定性，能够产生更强的耗尽力。此外，经典的拥挤剂葡聚糖（70 kDa，0.4 mM）同样能够诱导形成直径更大的纤维束（448 ± 62 nm）。这些结果明确指出，纯排阻体积效应足以驱动SQ超分子纤维的侧向组装，而临界浓度约为3 mM。
图6： (A) 使用各种大分子拥挤剂的超分子SQ水凝胶（4 mM）制备流程示意图。(B) 含PEG-Nb（1-5 mM）的SQ水凝胶的共聚焦图像，混合后立即成像（t=0 h）。(C) 含不同大分子拥挤剂（3 mM PEGs和0.4 mM葡聚糖）的SQ水凝胶的共聚焦图像，37°C孵育3小时后成像。SQ水凝胶含有1 mol% SQ-Cy5。标尺：10 μm。
光谱学证实分子堆积模式保持不变
紫外-可见光谱（UV-Vis）分析表明，无论是在PEG-Nb、PEG-OH还是葡聚糖存在下，SQ溶液的吸收光谱均与纯SQ溶液完全一致，特征峰位于318 nm（头尾氢键组装体）和266 nm（肩峰）。然而，所有拥挤剂存在下的吸光度均约为纯SQ溶液的一半，这与更大尺寸组装体的形成相符。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）进一步证实，在冻干的SQ-PEG-Nb混合物中，SQ的N-H伸缩振动、方酰胺环呼吸振动以及氨基甲酸酯的C=O伸缩振动均未发生改变，表明纤维束中SQ单体的分子堆积模式与单根纤维完全相同。这一发现至关重要，它证明耗尽诱导的组装仅发生在介观尺度，而不改变纳米尺度的分子堆积，从而保留了超分子材料的功能性。
图7： (A) 0.4 mM SQ（黑色虚线）和0.4 mM SQ与不同大分子单体的紫外-可见光谱：3 mM PEG-Nb（最深蓝色）、3 mM PEG-OH（蓝色）和0.4 mM葡聚糖（最浅蓝色）。(B) 冻干的4 mM SQ和PEG-Nb混合物（3 mM，蓝色；5 mM，黑色）样品的傅里叶变换红外光谱，突出氢键区域。(C) 0.4 mM SQ和3 mM PEG-Nb混合物的共聚焦图像，显示纤维束的形成。标尺：10 μm。
总结与展望
本研究系统地揭示了共价网络形成动力学在调控杂化双网络水凝胶中超分子纤维分级组装中的决定性作用。通过调节IEDDA反应的速率，研究团队首次建立了大单体反应活性与分子拥挤效应之间的关联，实现了对超分子纤维束形成的精确控制。慢速网络形成为超分子纤维提供了足够的动态迁移时间，使其在耗尽作用下组装成束；而快速交联则动力学锁定系统于低纳米尺度的初始组装状态。这种动力学差异最终转化为模块化的应力松弛和压缩性能：快速体系表现出更快的应力松弛但较低的韧性，而慢速体系则实现了韧性的两倍增强。展望未来，这一设计原理可扩展至其他共价键反应体系（如pH、温度、光响应体系）和多种超分子单体，为构建介观尺度可编程的软物质材料提供了全新维度，在组织工程、软体机器人和智能材料等领域具有广阔的应用前景。
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