Cell | 线粒体通过SLC25A35驱动甘油脂合成|介导|甘油脂|线粒体|细胞|营养补充剂|蛋白

撰文 | 阿童木

线粒体不仅是细胞的“能量工厂”，也是连接糖代谢、脂质合成与信号转导的代谢枢纽，持续向细胞核、内质网及脂滴等区室输送 ATP 及关键代谢中间体。其中，磷酸烯醇丙酮酸（PEP）是一种具有高磷酸转移势的核心代谢节点，既参与糖酵解中 ATP 的生成，也在糖异生、甘油异生以及免疫细胞 Ca² ⁺ 信号调控等过程中发挥重要作用。因此， PEP 在细胞中的生成位置及其跨区室转运方式，直接决定了碳流如何在不同代谢路径之间分配，从而影响细胞对能量与物质的调控能力【1】。

PEP可由丙酮酸经“ 丙酮酸—草酰乙酸—PEP ”旁路再生：丙酮酸首先由丙酮酸羧化酶转化为草酰乙酸（OAA），随后由PEP羧激酶（PEPCK）催化生成PEP。长期以来，这一过程被认为主要发生在胞质中，这一认识很大程度上来源于对肝脏糖异生中胞质型PEPCK（PCK1）的研究【2】。然而，近年来的代谢示踪研究逐渐改变了这一观点。在脂肪细胞中，来自丙酮酸的M+3 PEP主要来源于线粒体，提示线粒体本身是PEP的重要生成场所【3】。从路径上看，在线粒体中直接生成PEP可减少跨区室代谢转换步骤。

这些结果共同指向一个关键“断点”：线粒体内生成的PEP并不能自由跨膜。那么，这部分代谢中间体究竟如何被输出到胞质，并进一步参与脂质合成等代谢过程？这一问题长期缺乏直接分子机制解释。

近日，哈佛大学 Shingo Kajimura 团队等在 Cell 杂志发表了题为 Mitochondrial control of glycerolipid synthesis by a PEP shuttle 的研究文章，鉴定出线粒体载体蛋白SLC25A35是介导PEP跨线粒体内膜输出的关键转运蛋白。研究表明，线粒体通过PCK2将丙酮酸转化为PEP，并通过SLC25A35输出至胞质，为甘油异生提供碳源，从而驱动甘油-3-磷酸及甘油脂的合成。该研究提出“ PEP shuttle ”这一新的代谢通路概念，将线粒体代谢与脂质合成直接连接起来。

在脂肪细胞中，作者首先比较了两种PEPCK同工酶的作用，发现PCK2而非PCK1是主要功能来源。通过CRISPR-Cas9敲除和放射性及稳定同位素示踪实验，PCK2缺失显著抑制脂肪细胞中甘油脂的合成，而PCK1缺失影响较小，提示线粒体来源的PEP在脂质合成中占据主导地位。这一结果从源头上确立了 “线粒体PEP”作为脂质合成主要碳源的地位。

为进一步寻找负责PEP输出的线粒体转运蛋白，作者在SLC25载体蛋白家族中进行了系统筛选，并设定了三项功能性标准：在脂肪细胞中富集表达、与脂质合成相关基因呈正相关、并可被脂质生成信号诱导。基于这一筛选逻辑，最终锁定此前功能未知的载体蛋白SLC25A35。通过亚细胞定位实验结合高分辨率显微成像及蛋白酶保护分析，作者证实 SLC25A35 蛋白定位于线粒体内膜，符合其作为代谢物跨膜转运体的特征。

作者接下来对SLC25A35进行了功能验证，通过 Easi-CRISPR 构建 Slc25a35 敲除的前脂肪细胞，并利用 Mito-Tag 技术分离线粒体进行代谢组学分析。结果显示，敲除 SLC25A35 后，线粒体内 PEP 显著积累，而全细胞 PEP 水平变化不明显，提示 PEP 被滞留在线粒体中，无法有效输出。¹³ C ₃ - 丙酮酸示踪进一步表明，这些积累的 PEP 主要来源于丙酮酸经 OAA 生成的旁路，而非 TCA 循环氧化途径。同时， TCA 循环活性及相关关键酶表达未发生明显变化，说明该效应具有较高的代谢特异性。

为了直接检测PEP跨膜运输，作者建立了线粒体输出实验体系。结果显示，分离的野生型线粒体可随时间向外释放¹³C标记的PEP，而Slc25a35缺失显著降低这一输出能力，直接证实了 SLC25A35是线粒体PEP跨膜输出所必需的转运蛋白。

在体外重建实验中，作者利用纯化的SLC25A35构建脂质体系统，进一步验证其转运功能。实验表明，该蛋白能够特异性转运PEP，且该过程可被未标记PEP竞争抑制，显示出明确的底物特异性。底物竞争实验还发现，OAA、苹果酸及琥珀酸可轻度抑制该转运，而延胡索酸及支链酮酸类代谢物则无明显影响，提示 SLC25A35对PEP具有较高选择性。此外，PEP转运呈pH梯度依赖性，在低pH条件下增强，表明该过程依赖质子梯度驱动，与线粒体能量状态密切相关。这些体外实验证明 SLC25A35是一种以PEP为高亲和力底物、受质子梯度驱动的线粒体转运蛋白。

在结构层面，由于缺乏实验解析结构，研究者基于AlphaFold预测模型进行分子对接和动力学模拟分析。结果显示，SLC25A35具有典型的六跨膜螺旋结构，其中央通道形成带正电的结合腔，有利于结合带负电的PEP分子。模拟分析显示，PEP的磷酸基和羧基可与多个保守残基形成稳定相互作用。突变实验进一步验证，Y124A和R175A单突变体保留野生型转运活性，而双突变体和三突变体反而转运增强，这与SLC25家族载体中“漏门（ leaky gate ）”现象一致——关键残基突变削弱盐桥网络、降低构象能垒，在底物充足条件下表现为转运增强。这些结果从结构和功能层面验证了 Y124、R175和R276等残基是SLC25A35介导PEP转运的关键位点。

在代谢功能层面，SLC25A35直接决定甘油异生通量。¹³C示踪结果显示，敲除该基因后，脂肪细胞中GA3P/DHAP生成显著减少，G3P水平下降，来自丙酮酸的碳流难以进入甘油骨架合成路径。相应地，甘油三酯合成明显受阻。值得注意的是，过表达胞质型PCK1无法恢复这一缺陷，且在SLC25A35缺失背景下进一步敲除PCK2不产生叠加效应，说明甘油异生依赖于PCK2生成的线粒体PEP经SLC25A35输出的特定途径，而非总细胞PEP池。

体内条件下，脂肪组织特异性敲除Slc25a35的小鼠在高脂饮食条件下体重增长减缓，白色和棕色脂肪组织质量下降，脂肪细胞体积减小，但能量消耗、食物摄入及产热能力未见显著变化。这表明 SLC25A35主要调控脂质储存过程，而不直接影响整体能量代谢。放射性示踪实验进一步显示，敲除小鼠脂肪组织中甘油骨架的生成显著减少，而脂肪酸部分未受影响，证明该通路特异作用于甘油异生。这些体内数据直接证明， SLC25A35介导的线粒体PEP输出是脂肪组织甘油异生和甘油脂质合成的必要环节。

在肝脏中，SLC25A35同样具有重要作用。转录组分析显示，该基因在脂肪性肝病患者及高脂饮食小鼠中表达上调。肝脏特异性敲除Slc25a35显著降低肝脏甘油三酯含量和脂滴积累，并伴随炎症反应减弱及胰岛素敏感性改善。进一步分析发现，该操作并不影响肝细胞的糖异生能力，提示线粒体来源的PEP在肝脏中主要用于脂质合成而非葡萄糖生成。

在治疗层面，作者在肥胖模型中通过AAV递送系统诱导敲除肝脏SLC25A35，结果显示可显著降低肝脏脂质积累、改善肝功能指标（ALT和AST），且未引发明显的线粒体应激反应。这些结果提示，靶向肝脏SLC25A35可有效缓解肥胖相关肝脏脂肪变性。

综上所述，本研究鉴定了线粒体PEP转运蛋白SLC25A35，并提出“PEP shuttle”这一新的代谢通路模型：线粒体通过PCK2生成PEP，并将其输出至胞质以支持甘油异生，从而驱动甘油脂合成。这一机制将线粒体代谢状态与脂质合成能力直接耦联，揭示了细胞通过跨膜代谢物运输精细调控碳流分配的关键机制，也为代谢性疾病的干预提供了新的潜在靶点。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2026.02.017

制版人：十一

参考文献

1. Yu, S., et al. (2021). Phosphoenolpyruvate carboxykinase in cell metabolism: Roles and mechanisms beyond gluconeogenesis.Mol. Metab.53, 101257 .

2. Méndez-Lucas, A. et al. (2013) . PEPCK-M expression in mouse liver potentiates, not replaces, PEPCK-C mediated gluconeogenesis.J. Hepatol.59, 105–113.

3. Stark, R., et al. (2014). A role for mitochondrial phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK-M) in the regulation of hepatic gluconeogenesis.J. Biol. Chem.289, 7257–7263.

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