中文摘要
随着微针技术的快速发展，微针逐渐成为新兴的疫苗递送方式，其具有微创、无痛、自给药、节省剂量、增强免疫应答等优势。免疫原性评价对疫苗的研发至关重要，目前尚无对微针疫苗免疫原性评价方法的系统性总结。此文概述了微针疫苗免疫应答的特点，系统梳理和讨论了用于评价微针疫苗免疫原性的各种方法及关键指标，并对新兴免疫原性评价方法在微针疫苗领域的应用进行了探讨和展望。
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正文
微针是新兴的微创经皮给药技术，其微小的针状结构能够在不刺激神经的情况下穿透皮肤角质层进入更深的组织，并增强各种药物或疫苗的皮肤渗透率。相比于传统注射方式，微针具有微创、无痛、自给药、冷链依赖少等优势，当前已在灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗等多种疫苗接种中表现出了良好的免疫效果，成为了疫苗递送领域的研究热点。由于疫苗经皮递送可能改变抗原的呈递动力学与局部免疫微环境，进而影响微针疫苗诱导的免疫应答模式，因此在微针疫苗的研发中，系统评估微针疫苗的免疫原性至关重要。这不仅是验证其有效性的核心依据，也是深入了解其作用机制、优化递送策略的关键环节。本文系统梳理和讨论免疫原性评价方法在微针疫苗中的应用，以期为相关研究提供方法学参考。
1
微针疫苗概述
皮肤主要由角质层、表皮层和真皮层组成，其中角质层厚10~20 μm；表皮层厚达1 500 μm，含有丰富的APC，如朗格汉斯细胞；真皮层含有丰富的血管、淋巴管、神经末梢和一些APC（如真皮树突状细胞、巨噬细胞等）。这些APC被抗原激活后，可以离开感染部位进入淋巴管，并迁移至局部淋巴结以诱导有效和持久的适应性免疫应答。微针疫苗的核心机制为：微针穿刺皮肤角质层后，迅速触发先天免疫应答；释放局部炎症因子，募集并促进中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润；同时激活皮肤内的APC，使其迁移至引流淋巴结；此类活化的APC高表达共刺激分子，从而显著增强T细胞/B细胞的活化与适应性免疫应答。微针的长度通常为100~1 500 μm，在穿刺过程中微针贴片可直接将抗原输送至表皮层或真皮上层，避免接触真皮中的神经末梢，具有无痛的优势。微针本身的物理刺激也能在一定程度上起到佐剂作用，增强免疫应答。与传统的注射疫苗相比，微针疫苗还具有剂量节约效应、能够诱导强大的黏膜免疫（这对于应对呼吸道/消化道病毒尤为重要）、偏向Th1型的细胞免疫应答及长效免疫记忆等优势。近年来，微针技术在皮肤贴片接种疫苗方面取得了显著进展，其中麻疹-风疹疫苗进入Ⅱ期临床试验，流感疫苗和脑炎疫苗进入Ⅰ期临床试验，还有多种微针疫苗处于临床前研究阶段。不同类型的微针在疫苗及药物中已得到广泛应用，其递送机制存在一定的差异，见表1。
2
免疫原性评价方法在微针疫苗中的应用
为全面评估微针疫苗独特的免疫应答能力，其免疫原性评价方法除了包含传统疫苗评价方法，还注重抗原递送效率和针对皮肤的免疫特性的测定。在递送效率评估方面，研究者主要通过高效液相色谱、BCA法、活体荧光成像等方法定量和定性微针在皮肤中的溶解释放和递送过程，这些方法的应用证实了微针疫苗具有精准、高效递送的优势。在局部免疫应答评价方面，已有研究主要应用流式细胞术（flow cytometry，FCM）、细胞内细胞因子染色（intracellular cytokine staining，ICS）、酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）等方法深度剖析皮肤和引流淋巴结的细胞因子水平，反映微针疫苗诱导的初始免疫应答情况。在系统免疫应答评价方面，微针疫苗评价与传统疫苗评价方法类似，主要包含体液免疫和细胞免疫评价，通过ELISA检测特异性抗体、病毒中和试验（virus neutralization test，VNT）检测中和抗体、FCM检测T细胞分型等评估免疫应答水平。上述评价方法的综合应用为微针疫苗的免疫原性提供了证据支持。传统疫苗与微针疫苗免疫原性评价指标与检测方法对比见表2。
2.1
抗原递送效率测定
尽管与肌肉组织相比，皮肤因含有丰富的APC和免疫辅助细胞而被认为是理想的免疫部位，但是相较于传统疫苗注射的精准递送抗原剂量，微针疫苗实际递送剂量则取决于载药量及递送率，要求剂量足够、靶向定位、结构完整。微针疫苗的实际抗原递送量和递送效率对评估其免疫效果起关键作用。目前，微针疫苗的抗原递送主要通过定量和定性方式进行评估，常见评估方法见表3。
抗原的高效递送是引发强大免疫应答的先决条件，在研发微针疫苗时，应根据疫苗类型的特点选择最佳的评价方法。如Kim等研发了涂覆乙型肝炎亚单位疫苗的微针，经Bradford比色法进行蛋白质定量和ELISA量化负载量，确保了涂层微针的有效抗原递送量。Wang等在制备猴痘DNA可溶性微针疫苗时，通过高效液相色谱定量分析了微针贴片使用前后DNA浓度。结果显示，每个贴片含有（18.26±0.69） μg DNA，将其应用于小鼠皮肤后，贴片残留DNA为（5.7±1.4） μg，递送效率约70%。最终通过免疫印迹法和免疫荧光证实了目标抗原在体内的有效表达。
此外，单向免疫扩散法是检测流感微针疫苗抗原含量的标准方法。其他病毒疫苗（如麻疹-风疹疫苗等）、亚单位疫苗（如新型冠状病毒疫苗、寨卡病毒疫苗）、核酸疫苗（如新型冠状病毒mRNA疫苗、埃博拉病毒DNA疫苗等）同样选取了上述2~3种方法综合测定了抗原递送效率，且体内免疫原性研究表明，微针疫苗均产生了良好的免疫效果。
2.2
局部免疫应答评价
局部免疫应答评价是证明微针疫苗能够实现剂量节约效应的关键环节，同时通过分析细胞因子和趋化因子谱，可以了解免疫应答的偏向、强度和类型。例如，IFN-γ、IL-2等Th1型细胞因子的升高表明免疫应答偏向细胞免疫，而IL-4、IL-10等Th2型细胞因子的增加则表明免疫应答与体液免疫相关。趋化因子如C-C趋化因子配体3、4、10等能够反映接种部位免疫细胞的招募情况，其水平的增高是微针疫苗诱导高效免疫应答的关键。通过FCM、ICS、Luminex多因子检测法及免疫荧光染色等方法监测细胞因子和趋化因子水平，可以准确评估微针疫苗诱导的强大的免疫应答。
在1项可溶性微针疫苗免疫诱导机制的研究中，研究人员给小鼠接种微针疫苗24 h后对皮肤组织进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing， scRNA-seq），发现约650个基因的表达显著上调，尤以IL-1β、IL-7最为显著，反转录定量PCR验证关键基因的表达变化和苏木精-伊红染色观察皮肤炎症反应等结果也证实了这一点。此外，1项动物研究通过基因表达谱分析、苏木精-伊红染色和免疫组织化学检测发现，微针贴片通过调控局部细胞因子和趋化因子网络，促进了APC向引流淋巴结的迁移，从而增强了机体免疫应答。
采用ELISPOT、FCM、ICS等检测技术获得的大量数据表明，多数抗病毒微针疫苗可诱导IL-1β、IFN-γ等Th1型细胞因子水平显著升高，提示其倾向于激发强大的细胞免疫应答，这对抗病毒免疫至关重要。
2.3
体液免疫应答评价
体液免疫应答的核心评价指标一般包括特异性抗体滴度、中和抗体滴度、抗体亲和力等。
2.3.1 抗原特异性抗体检测抗原特异性抗体的数量能够反映疫苗诱导的体液免疫应答的水平。当前，研究人员多采用ELISA检测抗原特异性抗体。Wen等研发了脂质体负载的可溶性微针乙型肝炎疫苗贴片，通过ELISA定量检测小鼠血清中抗HBV表面抗原 IgG水平。结果显示，在所有时间点，较高剂量的可溶性微针皮内给药均诱导了高水平抗HBV表面抗原滴度，0.1~2.0 μg范围内的免疫效果呈剂量依赖性。
传统疫苗因接种途径多在肌内或皮下而无法诱导有效的黏膜免疫应答，微针疫苗经皮或黏膜递送，不仅能激活全身免疫应答，还能激活局部黏膜免疫应答。根据病原体的传播方式不同，在评价时有些研究也检测IgA抗体滴度。Li等研发了新型冠状病毒DNA微针疫苗，通过ELISA检测了接种小鼠血清中新型冠状病毒刺突特异性抗体（IgG、IgA、IgG1和IgG2c）滴度以及核衣壳特异性IgG抗体滴度。结果显示，在免疫后第3、6周，微针组不仅诱导了与肌内注射组相当的刺突/核衣壳特异性IgG抗体滴度，而且诱导了显著高于肌内注射组的刺突特异性分泌型IgA抗体水平，这表明微针疫苗不仅诱导了与肌内注射组相当的体液免疫应答，而且引发了有效的黏膜免疫应答。多项研究表明，经微针递送的流感病毒疫苗、新型冠状病毒疫苗、灭活轮状病毒疫苗等均诱导了有效的黏膜免疫应答，增强了疫苗对机体的保护作用。
2.3.2 中和抗体检测病毒中和试验通常用于检测机体血清中可有效中和病原体的抗体量。在微针疫苗免疫原性评价中常用的病毒中和试验类型主要包括假病毒中和试验、嗜斑减少中和试验、微量中和试验等。Fan等通过假病毒中和试验检测了针对野生型新型冠状病毒及其变异株的中和抗体水平，研究结果证实，基于微针递送的DNA疫苗策略在诱导广谱中和抗体方面具有显著优势，这种优势为应对病毒变异提供了潜在替代方案。另有研究在对比混合抗原、分区抗原微针疫苗诱导的中和抗体水平时，通过噬斑减少中和试验发现，2种单价疫苗混合和双室微针联合疫苗的中和效果无明显差异且与肌内注射组相当，这证明了双室微针阵列能够避免传统混合疫苗的免疫干扰问题。此外，1项灭活轮状病毒微针疫苗研究通过微量中和试验证实了微针疫苗比肌内注射疫苗更高效地诱导了中和抗体。上述方法与传统疫苗的评价方法基本一致。未来，研究人员可通过综合评估病毒中和试验方法的优缺点，选择最优评价方法。
2.3.3 抗体亲和力检测抗体亲和力是指抗原与抗体结合的强度。常用抗体亲和力检测方法包括硫氰酸胍洗脱ELISA和表面等离子体共振。
研究表明，微针疫苗能够诱导更高亲和力的抗体。Littauer等采用ELISA检测流感微针贴片疫苗诱导的抗体，通过在血清样本中添加不同浓度的硫氰酸胍测定抗原与抗体结合的强度。含佐剂的微针疫苗组相比于单独微针组抗体亲和力显著增加，且高亲和力抗体与长期免疫保护呈正相关。硫氰酸胍洗脱ELISA检测抗体亲和力虽然操作简便且灵敏度较高，但是只能测得相对亲和力，无法精确测定其解离常数。利用金属表面的等离子共振现象能够实时监测抗原-抗体结合的过程，通过计算可测得解离常数。在1项可溶性微针贴片递送流感灭活疫苗的Ⅰ期临床试验中，研究者使用ProteOn表面等离子体共振生物传感器在25 ℃监测疫苗接种后血清的稳态平衡结合，分析了抗原-抗体亲和力。结果表明，与基线相比，在接种后第28天，微针组观察到了抗原-抗体亲和力的显著增加。
2.4
细胞免疫应答评价
T细胞亚群的数量及比例、关键细胞因子水平等指标的检测对微针疫苗的设计研发起重要指导作用。
2.4.1 CD4+/CD8+ T细胞分型检测CD4+ T细胞亚群比例及CD8+ T细胞活化水平能够反映细胞免疫应答的类型与强度。T细胞分型检测可验证微针疫苗能否有效激活CD4+和CD8+ T细胞，并诱导两者产生协同效应。
与传统疫苗的检测方法一致的是，FCM利用T细胞表面特异性标志物可区分CD4⁺和CD8⁺ T细胞，定量其比例和数量，从而评估微针疫苗诱导的T细胞免疫特征。在1项COVID-19 DNA疫苗可分离微针（separable microneedle，SMN）的研究中，研究人员通过FCM检测小鼠脾脏细胞发现，与单独SMN疫苗相比，含佐剂的SMN疫苗诱导了更高水平的IFN-γ+/IL-2+ CD8+效应记忆T细胞；此外，通过FCM结合分析新型冠状病毒特异性IFN-γ+/IL-2+CD4+ T细胞发现，用含佐剂的SMN接种疫苗可以显著增加相关T细胞的数量，这说明了免疫刺激剂可能有助于激发体液免疫应答。
2.4.2 细胞因子分泌检测细胞因子分泌可通过ELISA、ELISPOT、ICS联合FCM等方法来检测。
ELISA可用于定量检测细胞因子含量，ELISPOT可用于定量检测分泌特定细胞因子的细胞数量。研究表明，与传统疫苗相比，微针疫苗更优的免疫原性源于其激活了更高比例的多功能T细胞。ELISA和ELISPOT无法很好地评估分泌多种细胞因子的细胞数量。为此，现有研究采用ICS联合FCM，在单细胞水平上进行细胞表型与功能的多维度分析，以此证明微针疫苗诱导了相比于传统疫苗更高比例的多功能T细胞。例如，Fan等研究的COVID-19 DNA微针疫苗，通过ICS联合FCM检测小鼠引流淋巴结和脾脏，证实了微针组表达IL-2、IFN-γ、TNF-α的T细胞的数量显著高于肌内注射组和空白对照组。这表明经微针递送疫苗诱导机体产生了更强的免疫应答。
3
免疫原性评价方法创新进展
对于微针疫苗免疫原性评价，目前使用的技术如ELISA、病毒中和试验、ELISPOT、FCM等虽可广泛评估微针疫苗接种后T细胞或体液区室中的反应，但无法精准地评估单个免疫细胞之间的反应差异。
ELISA的最低检测限受其显色方法灵敏度的限制，难以精确检测抗体滴度，需要灵敏度更高、多靶标检测的抗体检测方法，如Ella全自动微流控ELISA、化学发光酶免疫测定法（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）。前者已在新型冠状病毒mRNA疫苗研发中被广泛应用；后者在检测低浓度Ig时性能显著，可用于疫苗接种早期检测低浓度抗新型冠状病毒抗体。这些新方法在传统疫苗中的应用为微针疫苗的免疫原性评价提供了新方向。
近年来，scRNA-seq、质谱细胞术、CLEIA、微流控技术等新兴方法的出现，为微针疫苗领域提供了新的评价工具。scRNA-seq可用于表征单细胞转录组。研究人员通过对单个细胞RNA进行测序，能够揭示细胞间的异质性及亚群多样性。此外，该技术还具备在单细胞水平解析疫苗接种反应机制的优势。质谱细胞术融合了质谱的精确性、无需补偿计算、金属标签标记，能够以单细胞分辨率同时测量多达50个细胞特征，增强了FCM的能力。这种技术已用于鉴定新型流感疫苗特异性CD4+ T细胞亚群。CLEIA凭借其高灵敏度、多靶向性的优势已用于新型冠状病毒疫苗早期抗体检测。微流控技术也是近年来在FCM领域中出现的新兴技术。微流控设备根据细胞的物理性质通过机械过滤器对细胞进行无标签细胞分选，弥补了FCM在时间分辨率上的不足。这些新兴技术为传统疫苗的免疫原性评价开辟了新途径，有望应用于微针疫苗的免疫原性评价。
4
总结与展望
微针作为创新性的疫苗递送平台可以有效激发机体的免疫应答，已得到广泛验证。在免疫原性评价方面，针对高质量的免疫应答，目前研究者已经整合了诸如ICS、FCM、CLEIA、scRNA-seq等多项高通量、高灵敏度技术，以在单细胞水平分析免疫细胞的活化、分化和记忆形成。同时，活体成像技术等新兴技术为实时、原位观察抗原递呈与免疫激活过程提供了新视角，深化了对微针疫苗作用机制的理解。尽管如此，目前有关微针疫苗免疫机制的研究尚不充分，微针疫苗免疫原性尚未有统一且规范的评价体系，多数微针疫苗尚未开展长期临床研究。未来研究应进一步聚焦于以上几个方面，微针疫苗才能有望在不久的将来大比例替代传统疫苗的接种方式，为公共卫生事业做出贡献。
作者
刘卫华1,2 王可慧2 邹大阳2 李显煌2 王彬3 李琳昊2 都星月2 周人辉2 秦日辉2 徐雅晴2 刘威1,2
1中国医科大学公共卫生学院卫生统计学教研室，沈阳 110122；2解放军疾病预防控制中心免疫规划科，北京 100070；3安徽医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，合肥 230032
通信作者：刘威，
Email：liuwei5269@qq.com
引用本文：刘卫华, 王可慧, 邹大阳, 等. 免疫原性评价方法在微针疫苗中的应用进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2026, 49(2): 127-134.
DOI:10.3760/cma.j.cn311962-20250611-00045
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撰写| 国际生物制品学杂志
校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea
编辑 设计| Alice
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