Nature｜张楹/殷昊团队联合开发高效定点基因写入工具—QuadPE|dna|介导|位点|外源|定点基因|序列|张楹|殷昊|细胞

基因作为遗传信息的基本载体，储存并传递着生命体构建所需的全部指令。一旦基因特定区域发生突变或功能缺陷，便可能引发多种遗传病。超过95%的遗传病尚无根治手段，大多数患者仍长期面临严重的健康风险与沉重的家庭负担。传统基因治疗主要依赖病毒载体将功能正常的基因导入细胞，但该策略仍存在诸多局限，包括潜在的致癌风险、非整合载体难以维持长期疗效等问题。

CRISPR-Cas9技术显著推动了基因编辑领域的发展，其可高效诱导DNA双链断裂并依赖内源修复机制实现小规模序列改造。然而，遗传病致病突变类型复杂且高度异质，针对单一突变的编辑策略难以覆盖全部患者。因此，需开发高效的定点基因写入技术，实现完整功能基因的精准插入，从而同时应对多种突变类型，提升基因治疗的普适性。

202 6年 4 月 22 日，武汉大学医学研究院张楹教授与殷昊教授课题组联合在 Nature 期刊发表题为 Quadruple pegRNA enables programmable and efficient large genomic insertion 的研究论文。团队开发了一种高效的定点基因写入技术QuadPE，该技术以可编程的方式高效地将千碱基级DNA（1.6至26 kb）插入基因组中。区别于整合酶介导的插入，QuadPE无需额外蛋白参与，通过一步法完成整合，显著提升了插入长度、效率及精准度，为基因治疗提供突破性的工具。

定点基因写入是实现致病突变精准替换的理想策略，也是基因编辑领域长期亟待突破的关键技术瓶颈。然而，现有DNA 定点整合系统存在两大技术瓶颈：（1）插入片段长度和插入效率受限，插入片段长度增加，效率显著下降；（2）依赖细胞周期，在疾病治疗的慢速分裂细胞中效率低下。先导编辑技术（ Prime Editing, PE）能够在基因组定点高效生成3’ flap这一关键中间结构。团队前期研究表明，成对使用PE系统可产生一对序列互补的3 ’ f lap, 其空间构型直接决定编辑结局：在PAM-out构型中，互补的3’ flap促进两个切口之间基因组序列的重复 ( Cell, 202 4 )；而在PAM-in构型中，则可实现目标序列的精准插入，同时删除两切口之间的原有基因组片段 ( Nature Methods , 2022) 。基于此，本研究提出：通过设计使 flap末端序列与外源供体DNA两端形成互补配对，有望引导外源DNA按照预设方向精准拼接至基因组，实现高效、可控的大尺寸DNA片段定点整合。系统性筛选 24种组合后发现，使用两对PE协同作用可获得最优插入效率，其中一对PE以 PAM-in或PAM-out 构型靶向基因组产生两条3 ’flap（图1：flapA/B）作为引物，另一对PE靶向供体DNA生成互补的 3 ’flap（图1： f lap C/D ），从而引导供体DNA定点整合至目标位点（图1）。值得注意的是，基因组上 PAM-out设计的效率较PAM-in提高约1.5倍，且环形供体较线性供体具有更高整合效率，这暗示着P AM-out 设计可能在机制上模拟外源病毒 DNA或内源转座元件整合过程中，在插入位点两端形成短片段重复序列的特征。

图1 QuadPE示意图

QuadPE利用先导编辑器分别在基因组和供体DNA模板上生产序列互补的2对引物（flap A/C, flapB/D ）。在引物配对的引导下，实现基因精准插入。

QuadPE系统在多个基因位点及多种细胞类型中展现出良好的普适性。在HEK293T和K562等细胞系中，可在多个内源位点实现1.6–9.5 kb外源片段的高效插入，最高效率可达40%。在Huh-7、Jurkat、Hepa1-6及小鼠胚胎干细胞中均可实现稳定高效的整合。进一步，QuadPE可介导长达15 kb 乃至 26 kb的大片段DNA 插入，显示其在不同细胞背景、靶点及插入长度条件下均保持较高且稳定的编辑活性。与现有基因写入技术相比，QuadPE在不同插入长度范围内均展现显著优势，当插入片段为9 .5 kb时，其效率较整合酶体系eePASSIGE提高约11倍、较eePASTE提高约61倍，并比转座酶系统evoCAST提高约12倍。同时，通过插入GFP报告基因，观测到绿色荧光蛋白的表达，表明 QuadPE可实现外源序列的稳定表达，具有良好的应用前景。

为评估QuadPE对细胞周期的依赖性，本研究分别使用帕博西尼（ Palbociclib ）和胸苷（ thymidine ）将K562细胞阻滞于G1期和G1/S期，结果显示在细胞周期阻滞条件下仍能实现高效基因写入。进一步，在原代非分裂小鼠神经元中，QuadPE 介导的 4.6kb 片段插入效率高达 12.5% ，在原代人T细胞多个基因位点中，最高编辑效率可达51%。上述结果表明，QuadPE不仅在增殖细胞中保持高活性，在非分裂细胞及多种原代细胞中同样具有稳定而高效的编辑能力，具有广泛的应用潜力。

在精准性与安全性评估方面，本研究通过overlap PCR、out-out PCR及Sanger测序确认目标片段的正确整合，并对基因组与供体连接位点进行深度测序，精准连接比例高达约96.7% 。同时，对QuadPE进行全基因组范围内脱靶整合进行分析，未检测到明显脱靶插入事件，表明 QuadPE在实现高效定点基因写入的同时，具有优异的编辑精度和极低的脱靶风险。

综上，本研究开发的QuadPE系统突破了传统基因组插入技术在效率、长度及细胞周期依赖性方面的瓶颈，实现了无需外源整合酶参与的可编程大片段精准插入，并在多种细胞类型（包括非分裂细胞和原代细胞）中展现出高效的编辑性能且几乎无脱靶效应，对高度异质性的遗传病提供了一种更具普适性的治疗策略。

该论文的第一作者为武汉大学医学研究院博士后史亚晶、研究生丁梓怡和吴莹，武汉大学医学研究院张楹教授和殷昊教授为共同通讯作者。

https://www.nature.com/articles/s41586-026-10395-w

制版人：十一

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（*排名不分先后）