Mol Cell | 有丝分裂进入过程中组蛋白修饰的动态图谱|位点|动态图谱|染色质|甲基化|磷酸化|组蛋白|细胞

撰文|雪月

细胞进入有丝分裂时，染色质会快速压缩，形成典型的杆状有丝分裂染色体。这个过程对于染色体准确分离至关重要。已经知道，condensin复合体在这个过程中非常重要，但除了这些结构蛋白之外，组蛋白修饰是否也在推动染色体压缩，一直是这个领域关注的问题。尤其是组蛋白磷酸化、甲基化和乙酰化，在有丝分裂期间到底怎样变化，不同研究之间并不完全一致。过去不少研究使用nocodazole或STLC把细胞阻断在有丝分裂期，再去分析组蛋白修饰，但这种做法可能会把“自然进入分裂时的变化”和“分裂被延长滞留后的变化”混在一起。

近日，来自英国爱丁堡大学的William C. Earnshaw团队在Molecular Cell上发表了文章A time-resolved atlas of histone modifications during mitotic entry。该研究通过高时间分辨率地追踪细胞进入有丝分裂时的组蛋白修饰变化发现，早期有丝分裂中最显著的变化是三套不同程序的H3磷酸化，H3T3ph主要标记依赖H3K9me3的异染色质，而组蛋白乙酰化在自然分裂过程中仅轻度下降，因此明显去乙酰化并不是驱动有丝分裂染色体形成的主要因素。

作者建立了一个高同步性的实验体系。他们使用鸡 DT40 Cdk1as 细胞，在解除 G2 期阻滞后，让细胞几乎同步进入有丝分裂，然后在 0.5 、 2.5 、 5 、 7.5 、 15 和 30 分钟这些时间点收集样本。作者提取组蛋白后，主要使用高分辨率质谱分析修饰水平的动态变化，同时结合 ChIP-seq 、 ChIP-qPCR 、免疫荧光和 western blot ，从整体水平和基因组定位两个层面分析这些组蛋白修饰。作者也特意加入了 nocodazole 处理组，用来和 “ 自由进行的有丝分裂 ” 做对照，从而区分自然分裂过程中的变化和药物阻断后出现的变化。

文章首先发现，在有丝分裂进入过程中，变化最明显的组蛋白修饰是磷酸化。作者对 60 种核心组蛋白肽段进行了定量，结果显示，随着细胞进入有丝分裂，磷酸化水平显著升高，而其他大多数修饰整体变化并不大。进一步分析后，作者发现 H3 上的三个磷酸化位点并不是同步变化的，而是表现出三种不同的程序。 H3S10ph 最早、最强，在早期就迅速升高，并在后期保持较高水平； H3T3ph 上升更晚，而且是相对短暂的； H3S28ph 则出现更晚，并持续增加。作者据此认为，有丝分裂早期存在三套彼此不同的磷酸化程序，而不是单一的统一变化。

接着，作者分析了甲基化与这些磷酸化之间的关系。结果显示，H3K9、H3K4和H3K27相关甲基化在有丝分裂进入过程中整体上并没有明显改变。甲基化水平本身并没有像磷酸化那样发生大幅波动。邻近的甲基化状态会影响某些磷酸化能否发生。作者发现， H3T3ph 不会出现在带有 H3K4me2 或 H3K4me3 的肽段上，只在未甲基化或 H3K4me1 背景下出现。与此同时， S10 和 S28 位点的磷酸化则不明显受邻近赖氨酸甲基化状态影响。这个结果说明，不同位点之间的 “methyl-phos switch” 并不是普遍一致的。

在质谱分析之外，作者进一步用 ChIP-seq 从基因组水平看 H3T3ph 分布。作者发现， H3T3ph 并不出现在启动子邻近的活跃染色质区域，而是与 H3K4me2/3 富集区域基本互斥。相反，它与 H3K9me3 这种经典组成型异染色质标记高度相关，而与 H3K27me3 没有明显相关性。也就是说，作者认为 H3T3ph 在有丝分裂中更像是一个异染色质相关标记。为了进一步验证这种关系，作者使用 SUV39H1/2 抑制剂 chaetocin 降低 H3K9me3 ，结果发现 H3K9me3 下降的同时， H3T3ph 也明显下降；而抑制 Haspin 并不会反过来影响 H3K9me3 。结合 ChIP-qPCR 结果，作者提出H3K9me3是H3T3ph沉积所必需的条件。

随后，作者又讨论了 H3T3ph 与着丝粒的关系。结果发现， H3T3ph 在重复型着丝粒区域明显富集，但在非重复型着丝粒中却检测不到明显信号。这说明功能性的非重复型着丝粒在没有 H3T3ph 的情况下依然可以存在和工作。因此，作者认为H3T3ph并不是所有着丝粒都必需的普遍标记，它更符合异染色质相关修饰的特征。

最后，作者比较了自由进行的有丝分裂与 nocodazole 阻断条件下的乙酰化变化，发现 H2A 、 H3 和 H4 上的多个乙酰化位点在自由进入有丝分裂时只是轻度下降，甚至有的基本不变；但在 nocodazole 阻断两小时后，乙酰化水平明显下降。 western blot 结果也支持这个观察。作者随后又用 MG132 延长有丝分裂，发现随着分裂被延长，乙酰化会逐渐持续下降。这说明明显的组蛋白去乙酰化并不是染色体刚形成时就发生的主要事件，而更像是细胞在有丝分裂中被延长滞留后出现的结果。作者因此认为，在自然进行的有丝分裂中，组蛋白去乙酰化并不是驱动染色体形成的主要原因。

该研究发现有丝分裂早期主要发生的是组蛋白磷酸化重塑，而不是广泛去乙酰化或甲基化改变。去乙酰化并不驱动有丝分裂染色体形成，而有丝分裂中condensin之外的染色质压缩机制仍然有待进一步解释。