Mol Cell | 王栋/章佩君团队解析RNA聚合酶II中的水分子网络及其催化功能|rna聚合酶|介导|底物|核酸|水分子|王栋(1981年)|章佩君

水是生命之源，在细胞层面，水分含量占细胞总重量的70-80%，是细胞内含量最多的成分。在分子层面，水分子在基因转录中起到什么样的作用一直是个谜团。尽管过去二十五年来，RNA polymerase II（Pol II）的结构研究已经取得了突飞猛进的进展，但这个关键问题始终悬而未解。由于分辨率限制，我们对转录的理解还是以蛋白质为中心。绝大多数结构无法 “看到“ 水分子，使得这一类“看不见”的重要成分长期被忽视，我们无法了解水分子在转录过程中的结构与功能。

近日，来自美国加州大学圣地亚哥分校王栋教授团队联合英国牛津大学章佩君教授团队以及威斯康星大学麦迪逊分校黄旭辉教授团队，在 Molecular Cell 发表题为 Sub-2 Å Cryo-EM Structures of Transcribing RNA Polymerase II Reveal Critical Roles of Water Molecules in Catalysis 的研究论文（第一作者：李青嵘博士、易刚顺博士）。该研究解析了亚2 Å 分辨率冷冻电镜结构，首次揭示了转录活性状态下Pol II中的水分子网络，并揭示了水分子，这一转录体系中的“暗物质” ，在底物识别，催化反应和蛋白质相互作用中的关键作用机制（图1，视频1）。

图1. 亚2 Å冷冻电镜结构揭示RNA聚合酶II中水分子介导的催化与分子相互作用

视频 1. 冷冻电镜密度展示与水分子介导的RNA polymerase II催化及相互作用机制

背景与挑战

RNA·聚合酶 II （RNA Pol II ）是基因表达过程中最核心的酶之一，负责以DNA为模板合成信使 R NA，是转录过程的起点。虽然 20年前通过解析 X射线晶体学结构，首次揭示了在 RNA聚合酶 II处于活性状态时（前催化构象）， trigger loop从开放构象转变为闭合构象在底物识别和催化过程中的重要作用【1】。 20年来，已报道的数以百计的 RNA聚合酶 II 结构中，处于反应活性状态：底物结合且 t rigger loop 处于闭合构象的 RNA聚合酶 II 结构中不超过4个且均劣于3 Å分辨率。而且由于分辨率的限制， RNA聚合酶 II 的关键催化机制，尤其是质子转移步骤，仍是领域中一直悬而未决的问题。我们对 RNA聚合酶 II 的理解让只局限于蛋白质，我们对水分子在转录机制的作用也并不了解。

核心创新

尽管冷冻电镜技术发展迅速，但受限于分辨率和取向偏好，既往的 Pol II 结构也难以解析关键水分子及其精细相互作用。牛津大学章佩君团队于2024年开发了单分散链霉亲和素亲和载网【2】，用于优化颗粒取向并富集样品。在此基础上，通过生物素化核酸骨架并结合链霉亲和素亲和载网，显著改善了RNA Pol II的取向分布并降低气-液界面影响，从而解析了1.96 Å分辨率的反应前催化构象结构。进一步地，研究团队通过优化制样流程，发展了“底物梯度亲和载网”方法，在冷冻前引入底物并延缓反应激活，成功捕捉到催化中间态，并解析了磷酸二酯键形成的中间催化状态。这些技术进展使关键水分子网络得以清晰呈现，为深入理解转录机制提供了重要结构基础。（图2）

图2. 基于单分散链霉亲和素亲和载网的冷冻电镜样品制备流程图

关键发现

本研究第一次将RNA聚合酶 II 复合物在反应活性状态反应前催化构象的结构的分辨率大幅提高到1 .96 Å分辨率，活性中心的分辨率达1 .9 2 Å 。本结构中不但清晰解析了RNA聚合酶II各个氨基酸在催化反应发生瞬间的侧链构象，更是揭示高达1300多的水分子。这些水分子与RNA聚合酶II形成此前未被识别的相互作用网络，比溶液中游动的水分子稳定几十到上千倍。这些水分子在转录中起到重要作用。

1. 水分子在参与底物识别和催化反应中发挥重要作用

首先在底物结合区域，研究观察到大量水分子的存在，这些水分子构建了一个此前未被识别的相互作用网络，显著拓展了我们对 RNA聚合酶对底物识别机制的理解（图3）。传统观点认为，底物识别主要依赖蛋白质残基与底物之间的直接相互作用，而本研究表明，除了已知的直接相互作用，更多的底物识别作用网是通过水介导的。水分子作为关键“桥梁”，将底物与多个 RNA 聚合酶的结构元件连接起来，使更多氨基酸残基通过水介导方式参与到底物识别过程中，从而形成一个更为复杂且精细的识别网络。

图3. RNA聚合酶II活性中心的电子密度图

与此同时，这些水分子还直接参与了催化反应本身（图 4 ）。在活性中心中，与金属离子Mg² ⁺ A配位的水分子可作为质子受体，促进RNA引物3′-OH的去质子化，并通过连续的水分子链将质子传递至溶液环境；而位于β-磷酸附近的水分子（如W3或W4）则作为质子供体参与焦磷酸（ PPi ）的质子化过程。这一系列水分子介导的质子转移事件，从结构层面揭示并完善了RNA 聚合酶 II中SN2催化反应的分子机制。更为重要的是这些水在大肠杆菌RNA聚合酶的活性中心也是相当保守的【3】。这些发现揭示了水分子在转录过程中所发挥的关键且具有进化保守性的作用。包括水和镁离子在内的反应中心可能在RNA聚合酶的进化早期就已经出现，而蛋白质的残基在进化中优化和稳定这个反应中心。

图 4 水分子参与的RNA polymerase II催化SN2反应机制

2. 水分子参与trigger loop的构象动态变化

除了在催化和底物识别中的作用外，水分子还在稳定关键结构元件构象方面发挥重要作用。其中，trigger loop （ TL ）是位于Rpb1亚基中的一个核心结构元件，其构象变化在转录催化过程中起着至关重要的功能。之前的结构研究表明，当底物进入活性中心后，TL会从相对松散的开放构象状态折叠为含 alpha-螺旋的闭合构象，从而将底物稳定在反应位点附近，为催化反应提供精确的空间构型【1】。本研究的高分辨率结构发现，在TL与周围结构元件形成的界面区域中，存在大量水分子。这些水分子并非被动存在，而是与TL的构象变化过程高度耦联：在TL折叠过程中，水分子参与形成桥接氢键网络，连接TL与多个功能区域；而在TL解折叠时，这些水分子的分布也随之发生重排或解离。这表明，水分子作为动态“桥梁”为TL的构象转换提供了额外的结构调控层次。

3. 水分子调控蛋白–蛋白以及蛋白–核酸相互作用

在整个转录复合物中，研究发现大量水分子分布于蛋白–蛋白以及蛋白–核酸相互作用界面上，其中蛋白–核酸界面的作用尤为引人关注。传统结构研究普遍认为，核酸与蛋白的相互作用主要依赖带正电的氨基酸残基（如Arg和Lys）与核酸骨架上的负电荷磷酸基团之间的直接静电作用。然而，这一认识在很大程度上忽视了水分子的贡献。本研究揭示，在RNA–DNA hybrid 区域，核酸表面被一层稳定的水化层（hydration shell）所覆盖。这一水化层显著拓展了蛋白–核酸相互作用的方式：水分子作为“桥梁”，通过形成水介导的氢键网络，使更多类型的氨基酸残基参与到与核酸的相互作用中，不再局限于传统的带正电残基。值得注意的是，这种水介导的相互作用不仅允许负电或中性残基参与其中，还在一定程度上缓冲和重分布了界面电荷，从而构建出更加多样化和灵活的相互作用网络。基于这一结构观察，进一步提出，核酸表面的水化层可能在转录过程中发挥“分子润滑剂”的作用。相比于直接的蛋白–核酸接触，通过水分子介导的相互作用在能量上更易于调节和重排，从而有助于RNA 聚合酶 II 在沿着核酸模版骨架中平滑移动。这一机制为理解转录延伸过程中 RNA 聚合酶 II 沿着核酸模版链快速运动提供了新的物理基础。

总结

本研究通过亚2 Å分辨率结构，系统性揭示了水分子在Pol II转录中的多重功能，不仅阐述了完整的转录催化机制，也打破了传统“以蛋白为中心”的认知框架。这些发现表明，水分子是转录机器中不可或缺的结构与功能组成部分。这些发现为 RNA聚合酶催化机制提供了前所未有的机制性见解，并揭示了水分子在转录过程中所发挥的关键且具有进化保守性的作用。此研究代表了转录领域的一项重大突破，并显著推进了对核酸酶作用机制的基础性理解，为理解核酸酶体系的普适机制提供了新的视角。这项研究也为未来开展分子动力学研究和时间分辨结构分析提供了一个基础性框架，旨在探究在转录过程中有序与无序水分子及离子的动态作用。

本文其他共同作者还包括吴越（威斯康星大学麦迪逊分校） , Jenny Chong （加州大学圣地亚哥分校） Sophy Xu （加州大学圣地亚哥分校）。

原文链接：https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(26)00241-8

制版人：十一

参考文献

1. Wang, D., Bushnell, D.A., Westover, K.D., Kaplan, C.D., and Kornberg, R.D. (2006). Structural Basis of Transcription: Role of the Trigger Loop in Substrate Specificity and Catalysis.Cell127 , 941–954. https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.11.023.

2. Ma, J., Yi, G., Ye, M., MacGregor-Chatwin, C., Sheng, Y., Lu, Y., Li, M., Li, Q., Wang, D., Gilbert, R.J.C., et al. (2024). Open architecture of archaea MCM and dsDNA complexes resolved using monodispersed streptavidin affinity CryoEM.Nat Commun15 , 10304. https://doi.org/10.1038/s41467-024-53745-w.

3. Mueller, A.U., and Darst, S.E. (2026). Structural basis for multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase catalytic activity.Mol. Cell6 , ▪▪▪ – ▪▪▪ . https://doi.org/10.1016/j.molcel.2026.03.033 .

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（*排名不分先后）