FSHW | 栀子油脂通过微生物-肠-脑轴缓解慢性不可预知温和应激小鼠的抑郁样行为|多糖|小家鼠|微生物|栀子油脂|活性|细胞|营养补充剂

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Abstract

抑郁症对全球健康构成重大威胁，开发安全有效的治疗方案至关重要。栀子作为药食同源物质，在临床和日常生活中应用广泛。栀子油脂是食品工业加工中产生的废弃副产品，具有显著的回收利用潜力。虽然既往研究证实了栀子油脂的抗抑郁作用，但其具体机制尚未明确。为填补这一研究空白，本文系统解析了栀子油脂的化学成分及其抗抑郁作用机制。研究结果表明，栀子油脂主要由脂肪酸与不皂化物组成。该油脂可通过调节微生物-肠-脑轴，有效改善慢性不可预知温和应激小鼠的抑郁样行为。其作用机制包括：改善肠道菌群失调、调节短链脂肪酸代谢、保护肠道屏障功能、减轻海马体损伤，并通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路激活缓解神经炎症。粪便微生物移植实验证实肠道微生物群参与了栀子油脂对抑郁样行为的调控作用。本研究确立了栀子油脂的抗抑郁功效及其作用机制，为其作为抑郁症治疗的新型膳食干预方案提供了科学依据。

Introduction

栀子作为茜草科植物栀子的干燥成熟果实，既是具有除烦功效的天然药用植物，也是中国传统食品原料。当前从栀子中提取的天然添加剂已广泛应用于食品工业，但其提取后残留的栀子油脂并未得到有效利用。研究证实栀子油脂具有快速改善抑郁样行为的潜力。然而既往研究采用未造模正常小鼠，仅通过单日高剂量灌胃评估效果。栀子油脂对抑郁个体的抗抑郁作用及其具体机制仍有待阐明。

微生物-肠-脑轴在抑郁症发生发展中起关键作用，是极具潜力的治疗靶点。肠道微生物群通过免疫炎症反应、神经递质和代谢产物，积极参与胃肠道与中枢神经系统的双向调控。例如，将抑郁症患者粪便微生物移植至健康大鼠可诱发后者出现抑郁行为与生理改变；临床与动物研究均证实粪便微生物移植可改善抑郁症状。这表明通过肠道微生物移植可重现抑郁症的行为与生理特征。

本研究提出假设：栀子油脂可通过调控微生物-肠-脑轴改善慢性不可预知温和应激小鼠的抑郁样症状。为此，首先通过气相色谱-质谱联用技术分析栀子油脂中的脂肪酸与不皂化物组成以推断其有效成分；进而采用CUMS诱导的小鼠模型评估栀子油脂的抗抑郁功效；最后基于微生物-肠-脑轴探讨其作用机制，系统评估其对肠道屏障、肠道菌群、海马组织、相关信号通路及粪便移植的影响。

Results

栀子油脂化学成分分析

采用气相色谱-质谱联用技术分析栀子油脂中脂肪酸与不皂化物的组成。结果显示栀子油脂包含11种脂肪酸（图1A），其中亚油酸（C18:2n6c，46.67%）、油酸（C18:1n9c，19.19%）、棕榈酸（C16:0，17.17%）、己酸（C6:0，8.31%）及α-亚麻酸（C18:3n3，2.67%）为主要组分。栀子油脂中不皂化物的提取率为3.48%（相对标准偏差2.88%），共鉴定出43种成分（图1B），主要包含角鲨烯（23.44%）、β-谷甾醇（15.75%）、菜油甾醇（9.72%）、24-亚甲基环木菠萝烯醇（8.05%）、环木菠萝烯醇（6.4%）和豆甾醇（4.85%）。这些成分（角鲨烯、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇）在不皂化物中的含量分别为217.75、84.75、43.20和143.76 mg/g。

栀子油脂对CUMS诱导小鼠体质量与摄食量的影响

通过建立抑郁样CUMS小鼠模型（图2A），定期监测各组小鼠体质量与摄食量变化。实验初期，各组间体质量（图2B）与摄食量（图2C）均无统计学差异（P＞0.05）。从实验第2周至结束，CON组与CUMS组间的体质量及摄食量差异均显著（P＜0.05或P＜0.01）。值得注意的是，栀子油脂干预在一定程度上逆转了这种变化趋势。

栀子油脂改善CUMS诱导小鼠的抑郁样行为

如图2D-L和图S1所示，在第6周时，CUMS组小鼠表现出显著的快感缺失、行为绝望、焦虑状态和探索能力改变。与CON组相比，CUMS组蔗糖偏好率、开臂时间、旷场运动总距离和中心区域停留时间显著降低（P＜0.01），摄食潜伏期、强迫游泳和悬尾实验不动时间显著增加（P＜0.01）。然而，经氟西汀或栀子油脂干预后，上述抑郁样症状均得到改善（P＜0.05或P＜0.01）。这些结果证实，为期4周的栀子油脂治疗可缓解CUMS诱导小鼠的抑郁症状。

栀子油脂减轻海马体损伤并调节血清BDNF水平

通过苏木精-伊红染色观察海马组织病理特征。如图3A所示，CON组小鼠脑切片显示海马CA1区和CA3区神经元细胞排列整齐，形态正常，结构完整，细胞核清晰。而CUMS组神经元细胞数量减少，排列紊乱，细胞间隙增大，部分细胞形态结构异常，轮廓模糊，出现核固缩和核深染现象。与CUMS组相比，各治疗组海马病理损伤均有不同程度减轻，其中OGF-M和OGF-H组改善尤为明显。此外，CUMS组血清BDNF水平低于CON组（图3B，P＜0.01），而栀子油脂治疗可显著提升BDNF水平。

栀子油脂抑制CUMS诱导小鼠血清促炎细胞因子表达

如图3C-E所示，CUMS组血清IL-1β、IL-6和TNF-α浓度显著高于CON组（P＜0.01）。而经栀子油脂和氟西汀治疗后，这些促炎细胞因子水平均有所降低，表明栀子油脂能够抑制CUMS诱导小鼠的炎症反应。

栀子油脂防护CUMS所致肠道屏障损伤

肠道屏障功能受损可能导致革兰氏阴性菌脂多糖进入循环系统并诱发慢性炎症。因此，检测了CUMS程序及栀子油脂干预对肠道屏障通透性的影响。

首先通过苏木精-伊红染色观察结肠组织病理变化。如图4A所示，CON组未见黏膜组织损伤和炎性细胞浸润等病理改变；而CUMS组结肠隐窝明显缩短或破坏，并出现炎性细胞浸润；栀子油脂干预组较CUMS组则显示炎性细胞浸润减轻。通过测量结肠隐窝深度进一步评估栀子油脂对肠道屏障的影响，发现CUMS组结肠隐窝深度低于CON组，而在OGF-M和OGF-H组中该病理变化得到显著逆转（图4B）。

二胺氧化酶是肠上皮细胞内的一种高活性胞内酶，当肠黏膜屏障受损时会释放入血。为进一步评估肠道屏障完整性，通过ELISA试剂盒检测了肠道屏障功能血清指标（二胺氧化酶和脂多糖）。如图4C和D所示，CUMS刺激使小鼠血清中二胺氧化酶和脂多糖水平升高（P＜0.01），而栀子油脂干预则降低了二者水平。该结果表明栀子油脂可减轻CUMS诱导的肠黏膜屏障损伤。

机械屏障是肠黏膜屏障的最重要组成部分，其中肠上皮细胞间的紧密连接在调节肠黏膜屏障通透性中起关键作用。为此，通过蛋白质印迹分析了结肠中关键紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的表达。如图4E-H所示，与CON组相比，CUMS诱导小鼠结肠中ZO-1、occludin和claudin-1蛋白表达均下降（P＜0.01）。重要的是，栀子油脂治疗可逆转抑郁小鼠中这三种紧密连接蛋白的下调（P＜0.05或P＜0.01）。

栀子油脂影响CUMS诱导小鼠肠道微生物多样性

通过β-多样性分析评估栀子油脂干预是否影响小鼠肠道微生物群落结构。组间加权UniFrac距离大于组内距离（图5A，P＜0.01），证明分组合理性。此外，基于操作分类单元的主坐标分析和非度量多维尺度分析显示，CUMS组与CON组细菌群落结构存在显著差异（图5B和C）。因此，栀子油脂治疗可改善CUMS诱导小鼠的肠道菌群结构组成，使其恢复至正常状态。

栀子油脂调控CUMS诱导小鼠肠道微生物组成与功能

在门水平上，厚壁菌门、拟杆菌门、脱硫杆菌门、疣微菌门和变形菌门为样本中的优势菌门（图5D）。与CON组相比，CUMS组厚壁菌门丰度显著升高（图5D，P＜0.01），而拟杆菌门和螺旋体门丰度降低（P＜0.01）。与CUMS组相比，OGF组厚壁菌门丰度显著降低（P＜0.01），拟杆菌门丰度升高（P＜0.01）。此外，栀子油脂干预逆转了CUMS诱导的厚壁菌门/拟杆菌门比值失衡。

在属水平上，各组样本的肠道微生物组成如图5E所示。与CON组相比，CUMS组毛螺菌科NK4A136_group、乙酸杆菌属和扭链瘤胃球菌属丰度显著上升，而Muribaculaceae和真杆菌属丰度明显下降。栀子油脂治疗显著逆转了这些菌属的丰度变化。此外，图5E和图S3展示了在CUMS组或OGF组中呈现下降或上升趋势的其他微生物。综上所述，栀子油脂可缓解CUMS诱导的肠道菌群失调。

通过LEfSe分析获得CON-CUMS和CUMS-OGF比较中具有显著丰度差异的肠道微生物，其线性判别分析分布柱状图和分类分支图见图6A-D。交叉分析获得栀子油脂治疗CUMS诱导小鼠过程中可调控的微生物群：其中上调菌群包括c_Bacteroidia、p_Bacteroidota、o_Bacteroidales、f_Muribaculaceae、g_Muribaculaceae、g_Clostridia_vadinBB60_group、f_Clostridia_vadinBB60_group、o_Clostridia_vadinBB60_group和s_Alistipes_timonensis；下调菌群包括p_Firmicutes、f_Lachnospiraceae、o_Lachnospirales、c_Clostridia、g_Lachnospiraceae_NK4A136_group、g_Lachnospiraceae_UCG_008、g_Ruminococcus_torques_group和o_Enterobacterales。此外，通过PICRUSt2分析获得三组间具有显著差异的KEGG通路（图6E）。

图6 栀子油脂对CUMS诱导小鼠肠道菌群差异物种、代谢功能及盲肠内容物短链脂肪酸水平的影响

栀子油脂恢复CUMS诱导小鼠盲肠短链脂肪酸水平

由于短链脂肪酸水平与观察到的肠道菌群变化密切相关，检测了小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸浓度（图6F）。乙酸、丙酸和丁酸是盲肠内容物短链脂肪酸的主要组分。CUMS组乙酸、丙酸、丁酸及短链脂肪酸总量均高于CON组（P＜0.05或P＜0.01），而栀子油脂干预显著逆转了这一现象（P＜0.01）。因此，栀子油脂通过调节短链脂肪酸浓度发挥抗抑郁作用。

抑郁行为指标-炎症因子-脑源性神经营养因子-肠道屏障指标-肠道菌群-短链脂肪酸的相关性分析

如图7A所示，抑郁相关行为指标（蔗糖偏好实验、新奇环境抑制摄食实验、强迫游泳实验、悬尾实验、旷场实验和高架十字迷宫实验）与促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）、脑源性神经营养因子及肠道屏障功能生化指标（二胺氧化酶和脂多糖）均呈现显著相关性。在属水平筛选的6种肠道微生物中，促炎细胞因子和肠道屏障相关指标与Muribaculaceae丰度呈负相关，与毛螺菌科NK4A136_group丰度及短链脂肪酸浓度呈正相关；而脑源性神经营养因子与上述微生物丰度和短链脂肪酸浓度呈现相反的相关性模式。综上所示，可以推测栀子油脂通过改变肠道菌群组成、调节短链脂肪酸、修复肠道屏障功能及减轻炎症反应发挥抗抑郁活性。

图7 栀子油脂对CUMS诱导小鼠相关性分析及TLR4/NF-κB/NLRP3通路的影响

栀子油脂逆转CUMS诱导的小鼠海马TLR4/NF-κB/NLRP3通路激活

鉴于促炎细胞因子与抑郁行为指标及肠道菌群的显著关联，进一步检测了栀子油脂对CUMS诱导小鼠海马TLR4/NF-κB/NLRP3通路的影响。如图7B所示，CUMS导致TLR4、p-NF-κB、NLRP3、ASC和IL-1β蛋白水平升高，并显著激活Caspase-1（P45）向cleaved Caspase-1（P20）的转化（P＜0.01）。值得注意的是，栀子油脂能够逆转这一现象。此外，海马组织中IL-1β蛋白表达的变化与血清检测结果一致。

CUMS或OGF菌群移植对受体小鼠体质量及抑郁样行为的影响

通过粪便微生物移植实验验证栀子油脂确实通过肠道菌群改善小鼠抑郁（图8A）。与移植CON菌群（FMT-CON）的受体小鼠相比，移植CUMS菌群（FMT-CUMS）的小鼠体质量下降（图8B）；而移植OGF菌群（FMT-OGF）的小鼠体质量则高于FMT-CUMS组。三组受体小鼠的摄食量无显著差异（图8C）。与FMT-CON组相比，FMT-CUMS组小鼠在蔗糖偏好实验、新奇环境抑制摄食实验、强迫游泳实验、悬尾实验、旷场实验和高架十字迷宫实验中表现出更多抑郁症状（图8D-J）。值得注意的是，与FMT-CUMS组相比，FMT-OGF组的抑郁样行为得到显著改善。

Conclusion

本研究证实栀子油脂可通过调控微生物-肠-脑轴缓解CUMS诱导的抑郁样行为。角鲨烯、β-谷甾醇、α-亚麻酸与藏花素可能是其发挥抗抑郁作用的主要活性成分，这为栀子油脂作为膳食植物油的开发应用提供了理论依据。其作用机制涉及多条通路：调节肠道菌群组成、抑制短链脂肪酸过量生成、修复肠道屏障通透性、减轻海马组织损伤、抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路激活以及降低炎症反应。本研究为栀子油脂作为抑郁症替代疗法提供了科学依据，同时促进了其作为膳食油脂的资源化利用。

Gardeniae Fructus oil alleviate depression-like behaviors via the microbiota-gut-brain axis in mice with chronic unpredictable mild stress

Man Han1, Fei Zeng1, Yi Liu, Wenxin Shi, Shijuan Shao, Chunchao Yan*, Yunzhong Chen*

Hubei Provincial Research Center for TCM Health Food Engineering, Hubei Shizhen Laboratory, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Depression poses a considerable threat to global health, underscoring the critical need for safe treatments. Because of its homology of medicine and food, Gardeniae Fructus is widely used in clinical and every-day life contexts. Gardeniae Fructus oil (OGF) is a waste byproduct of the food industry with promising recycling potential. While previous research has demonstrated the antidepressant effects of OGF, the precise mechanism remains unclear. To fill this gap in the literature, this paper elucidates the composition and potential antidepressant mechanism of OGF. According to the results, OGF is mainly composed of fatty acids and unsaponifiable matter. OGF could effectively attenuate depression-like behaviors in mice with chronic unpredictable mild stress by modulating the microbiota-gut-brain axis. Mechanisms include improving gut dysbiosis, regulating short-chain fatty acids, protecting the intestinal barrier function, reducing hippocampal damage, and alleviating neuroinflammation by inhibiting the activation of the TLR4/NF-κB/NLRP3 pathway. Fecal microbiota transplantation experiments confirmed the involvement of the gut microbiota in the modulation of depression-like behavior by OGF. This study establishes the antidepressant effects of OGF as well as the underlying mechanism, demonstrating its potential as a novel dietary intervention for depression treatment.

Reference:

HAN M, ZENG F, LIU Y, et al. Gardeniae Fructus oil alleviate depression-like behaviors via the microbiota-gut-brain axis in mice with chronic unpredictable mild stress[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(5): 9250403. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250403.