有机室温磷光材料因其大斯托克斯位移、长发光寿命和良好生物相容性，在防伪、加密、化学传感及生物成像领域具有广阔应用前景。在生物成像中，磷光材料能有效消除生物组织短寿命自发荧光的干扰，提供极高的信号与背景比。然而，纯有机室温磷光在水相体系中极易被水和氧气淬灭，这严重限制了其在生物成像中的应用。目前，纳米晶化和超分子自组装是公认的两大水相室温磷光构建策略，前者依赖紧密堆积的晶体结构，后者利用大环超分子提供的疏水空腔来隔绝水和氧气的淬灭作用。但这两种策略均存在固有缺陷：结晶策略存在晶体发光依赖性和纳米颗粒稳定性不足的问题，而超分子策略则受限于主体与客体之间严格的分子兼容性要求。对于那些缺乏晶体发光能力、与超分子主体兼容性差的发光分子，这两种策略均不适用。因此，开发一种普适性强、不受上述限制的新型水相室温磷光构建策略，成为该领域亟待突破的瓶颈。研究团队在论文首图（图1）中系统对比了传统策略与本研究提出的新策略：传统纳米晶策略依赖紧密堆积的晶体结构来隔绝水氧，超分子策略利用大环主体的疏水空腔，而本研究的内源耗氧乳液聚合纳米球策略则通过致密聚合物基质结合发光分子自身的耗氧能力，实现了水相环境中的室温磷光发射。
针对这一挑战，青岛大学欧翰林副教授、南开大学丁丹教授合作提出了一种基于内源耗氧的乳液聚合纳米球策略，成功实现了在空气暴露的水相环境中产生肉眼可见的室温磷光发射。该水相磷光探针通过将具有高效活性氧生成能力的发光分子封装到经乳液聚合制备的聚甲基丙烯酸甲酯纳米球中构建而成。聚甲基丙烯酸甲酯纳米球的致密疏水结构结合所封装发光分子的高效活性氧生成能力，有效抑制了水和氧气对磷光的淬灭作用，从而在空气暴露环境中实现了可见的水相室温磷光发射。值得注意的是，合成的聚甲基丙烯酸甲酯纳米球在环境空气条件下的磷光寿命高达600.5毫秒，并在小鼠皮下组织、肿瘤和淋巴组织的生物成像中表现出卓越性能，信号与背景比最高可达556。相比之下，相同发光分子的纳米晶和超分子体系则未观察到室温磷光发射。相关论文以“Endogenous Oxygen Depletion-Based Emulsion Polymerization Nanospheres for Room-Temperature Phosphorescence Bioimaging”为题，发表ACS Nano上。
图1. 内源性耗氧乳液聚合纳米球策略与纳米晶和超分子策略在空气暴露环境中实现水相室温磷光的对比。 (a) (i) 纳米沉淀法制备室温磷光纳米晶的示意图。(ii) 超分子策略示意图。 (b) 内源性耗氧乳液聚合纳米球策略示意图。
薄膜体系中的光物理性质验证
研究团队首先选取了三种咔唑衍生物——二苯并咔唑、苯并咔唑和咔唑作为发光分子，将其掺杂到聚甲基丙烯酸甲酯薄膜中，系统评估了它们在聚合物基质中的光物理性质（图2a）。在365纳米紫外灯照射下，三种掺杂薄膜均表现出蓝紫色荧光，稳态光致发光光谱的最大发射峰分别位于388、391和402纳米（图2b）。值得注意的是，这些薄膜在未经紫外激活时几乎检测不到室温磷光发射，但在持续紫外照射下，二苯并咔唑和苯并咔唑掺杂薄膜分别呈现出黄绿色和绿色室温磷光（图2c）。这种激活现象源于聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的高氧气渗透性——氧气扩散进入聚合物基质后会灭活发光分子的三线态激子，而延长紫外照射时间后，光敏剂的三线态激子与三线态氧反应并将其转化为单线态氧，残余氧气逐渐被消耗，从而激活超长室温磷光发射（图2d、2e）。时间分辨发射衰减光谱显示，二苯并咔唑和苯并咔唑掺杂薄膜的磷光寿命分别达到884.3毫秒和1406毫秒（图2f）。
图2. 发光色团在PMMA薄膜中的光物理性质。 (a) DBCz/PMMA、BCz/PMMA和Cz/PMMA薄膜在365纳米紫外照射下及停止照射后的照片。 (b) DBCz/PMMA、BCz/PMMA和Cz/PMMA薄膜的归一化稳态光致发光光谱（激发波长365纳米）。 (c) DBCz/PMMA、BCz/PMMA和Cz/PMMA薄膜的延迟光谱（激发波长365纳米；延迟时间1毫秒；延迟光谱测量参数相同）。 (d)(e) (d) DBCz/PMMA和(e) BCz/PMMA薄膜在不同紫外激发时间下的延迟发射光谱（激发波长365纳米；延迟时间1毫秒；延迟光谱测量参数相同）。 (f) DBCz/PMMA和BCz/PMMA薄膜在365纳米紫外激发下的时间分辨发射衰减光谱。
乳液聚合纳米球的独特优势
在验证了薄膜体系的优异性能后，研究团队进一步将发光分子通过乳液聚合封装到聚甲基丙烯酸甲酯纳米球中，形成了均匀稳定的水分散体系。在氮气气氛下，二苯并咔唑、苯并咔唑和咔唑纳米球乳液在停止紫外激发后均呈现出从黄色到蓝色的余辉发光，其中苯并咔唑纳米球的余辉持续时间长达10秒（图3a）。延迟发射光谱显示，聚甲基丙烯酸甲酯纳米球表现出最强的延迟发射信号（图3b、3c、3d），其对应的色坐标如图3e所示。时间分辨发射衰减光谱测得二苯并咔唑和苯并咔唑纳米球的磷光寿命分别为828.8毫秒和1236毫秒（图3f）。动态光散射和透射电子显微镜分析表明，这些纳米球的平均直径约为70纳米，具有窄的尺寸分布和优异的单分散性（图3g）。为了证实聚甲基丙烯酸甲酯纳米球的致密结构及其防水屏障功能，研究团队还通过纳米沉淀法制备了F127纳米粒和聚乙二醇-聚甲基丙烯酸甲酯纳米粒作为对比。在相同实验条件下，聚甲基丙烯酸甲酯纳米球的延迟发射强度高达1.3×10⁴，而F127和聚乙二醇-聚甲基丙烯酸甲酯纳米粒的延迟发射强度几乎可以忽略不计，充分证明了聚甲基丙烯酸甲酯纳米球具有更致密的结构，能够有效阻止水分子渗入。
图3. 聚合物乳液在氮气气氛下的光物理性质。 (a) 不同聚合物乳液在365纳米紫外照射下及停止照射后的照片。 (b-d) (b) DBCz、(c) BCz和(d) Cz在PMMA纳米球、PEG-PMMA纳米颗粒和F127纳米颗粒中的延迟光谱（激发波长365纳米；延迟时间1毫秒；相同发光色团的延迟光谱测量参数相同）。插图为相应发光色团在PMMA纳米球、PEG-PMMA纳米颗粒和F127纳米颗粒中的余辉照片。 (e) 对应乳液延迟发射光谱的CIE坐标图（激发波长365纳米）。 (f) DBCz@PMMA和BCz@PMMA在365纳米激发下的时间分辨发射衰减光谱。 (g) 动态光散射测量的DBCz@PMMA流体动力学直径，插图：DBCz@PMMA的透射电镜图像。
空气环境中的磷光激活机制
尽管聚甲基丙烯酸甲酯纳米球的致密疏水结构能有效屏蔽水分子的淬灭作用，但其较高的氧气渗透性使得环境中的氧气分子仍可渗入纳米球内部，导致在未经预激活的空气环境中磷光被显著淬灭，此时几乎观察不到余辉发光（图4a）。然而，经过2分钟的365纳米紫外连续照射后，二苯并咔唑和苯并咔唑纳米球展现出肉眼可见的余辉发光（图4b）。延迟发射光谱显示，二苯并咔唑纳米球的磷光强度在紫外照射210秒后达到最大值，而苯并咔唑纳米球在150秒后达到峰值（图4c、4d、4e）。其空气条件下的磷光寿命分别为600.5毫秒和585.8毫秒（图4f）。研究团队进一步利用DCFH作为活性氧的荧光指示剂评估了纳米球的耗氧能力，结果显示二苯并咔唑和苯并咔唑纳米球诱导的DCFH荧光增强倍数分别达到17和15.6，远高于对照体系（图4g、4h）。这些结果表明，延长紫外预激活时间使纳米球内部的三线态氧被消耗，形成乏氧微环境，从而在空气暴露环境中恢复了室温磷光发射。相比之下，咔唑纳米球由于在365纳米处吸收弱且活性氧生成能力差，无法消耗足够氧气来发射磷光。
图4. 聚合物乳液在空气暴露环境中的光物理性质。 (a,b) 96孔板中不同聚合物乳液在(a)未经和(b)经过2分钟紫外预激发后的照片。 (c-e) (c) DBCz@PMMA、(d) BCz@PMMA和(e) Cz@PMMA在不同紫外激发时间下的延迟发射光谱（延迟时间1毫秒；延迟光谱测量参数相同）。 (f) DBCz@PMMA和BCz@PMMA在2分钟紫外预激发后的时间分辨发射衰减光谱。 (g) 在DBCz@PMMA（0.03毫摩尔）存在下，DCFH在紫外照射下光致发光光谱的变化。 (h) 图4g中DCFH在525纳米发射波长处光致发光强度变化的曲线图。注：所有实验均在空气暴露环境中进行（激发波长365纳米，18毫瓦/平方厘米）。
与其他策略的对比验证
为了充分验证内源耗氧乳液聚合策略的优越性，研究团队制备了两种对照材料：通过无有机溶剂纳米沉淀法合成的DBCz@F127和DBCz@PEG-PMMA纳米晶，以及利用大环主体葫芦脲[8]构建的超分子体系DBCzCCB[8]。在环境空气条件下，即使经过2分钟紫外预激活，这些纳米晶和超分子体系中均未观察到余辉发光，而二苯并咔唑纳米球则表现出显著的室温磷光发射（图5a、5b）。通过改变葫芦脲[8]与二苯并咔唑的摩尔比进行研究发现，吸收光谱在225至300纳米范围内仅有轻微变化，光致发光光谱中也没有出现新的发射峰（图5c、5d），表明葫芦脲[8]与二苯并咔唑之间没有形成有效的超分子组装结构，发光分子仍处于自由状态，因此无法产生室温磷光发射。这些对比实验充分证明了内源耗氧乳液聚合纳米球策略在构建稳定水相室温磷光体系中的独特优势。
图5. 通过纳米晶、超分子和乳液聚合策略制备的微球溶液的光物理性质比较。 (a) DBCz@F127纳米晶、DBCz@PEG-PMMA纳米晶、DBCzCCB[8]和DBCz@PMMA在96孔板中于365纳米紫外照射下及停止照射后的照片（空气暴露条件；紫外预激发2分钟）。 (b) DBCz@PMMA、DBCz@PEG-PMMA纳米晶、DBCz@F127纳米晶和DBCzCCB[8]在空气暴露条件下的延迟光谱（激发波长365纳米，延迟时间1毫秒）。 (c,d) (c)紫外吸收光谱和(d)光致发光光谱随CB[8]与DBCz摩尔比变化的情况。
体外生物成像性能评估
在确认了纳米球优异的室温磷光性能后，研究团队进一步评估了其在生物成像中的应用潜力。采用365纳米紫外灯作为激发光源，纳米球先经2分钟紫外预激活，随后在IVIS活体成像系统的生物发光模式下采集图像。结果显示，二苯并咔唑纳米球的室温磷光信号最强，强度数量级达到10⁶，而苯并咔唑纳米球信号次之，咔唑纳米球则无 discernible 信号（图6a、6b）。二苯并咔唑纳米球在停止激发后400秒仍可检测到磷光信号，半衰期长达25秒，显著长于苯并咔唑纳米球的18秒半衰期。组织穿透能力评估实验表明，二苯并咔唑纳米球在经365纳米紫外灯预激活后，其信号可穿透8毫米厚的鸡胸组织，而苯并咔唑纳米球的最大穿透深度仅为4毫米（图6c、6d）。虽然二苯并咔唑纳米球的最大发射峰位于555纳米、苯并咔唑纳米球位于530纳米，均处于传统近红外窗口之外，但它们依然展现出优异的成像效果。这表明磷光寿命对信号与背景比的贡献可能超过了发射波长的影响——二苯并咔唑纳米球长达25秒的半衰期有效抑制了生物组织的背景自发荧光，显著提升了成像质量。
图6. 聚合物乳液生物成像性能的体外研究。 (a) 不同PMMA纳米球在37°C下经2分钟紫外预激发后的时间依赖性磷光图像，采用IVIS仪器在生物发光模式下采集（激发波长365纳米）。 (b) 图(a)所示磷光图像的定量分析。 (c) 不同PMMA纳米球经2分钟紫外预激发后被不同厚度鸡组织覆盖后的磷光图像（激发波长365纳米）。 (d) 图(c)所示磷光图像的定量分析。图(b,d)中，数据以均值±标准差表示（n=3个独立纳米球批次）。图(d)中的P值采用双因素方差分析配合Tukey多重比较检验确定。
体内成像应用与生物相容性
在活体成像实验之前，研究团队系统评估了纳米球的生物相容性，结果显示纳米球的毒性可忽略不计，各项血液指标均处于正常生理范围内。在皮下成像实验中，采用“注射-后激发”方案时，二苯并咔唑纳米球的信号与背景比高达556，而苯并咔唑纳米球仅为185.9（图7a、7b）；若采用“激发-后注射”方案，由于磷光衰减已在注射前启动，有效信号强度显著降低，二苯并咔唑和苯并咔唑纳米球的信号与背景比均大幅下降（图7c、7d）。基于更高的信号与背景比，研究团队选择二苯并咔唑纳米球和“注射-后激发”方案进行后续肿瘤成像研究。在4T1荷瘤小鼠模型中经尾静脉注射纳米球后24小时成像，肿瘤部位检测到清晰的室温磷光信号，肿瘤边界被清晰勾勒，淋巴系统成像也在腹股沟淋巴结区域观察到显著信号（图7e）。组织切片苏木精-伊红染色进一步确认了切除组织确为肿瘤组织（图7f）。这些结果展示了纳米球在肿瘤成像和淋巴系统成像中的出色性能。
图7. 聚合物乳液的活体室温磷光成像。 (a) 皮下注射PMMA纳米球（50微升，0.6毫摩尔）后，经365纳米紫外灯（18毫瓦/平方厘米）照射2分钟记录的余辉成像。 (b) 对应的信号背景比数据。 (c) PMMA纳米球经365纳米紫外灯照射2分钟后皮下注射至小鼠体内获得的余辉成像。 (d) 对应的信号背景比数据。 (e) 使用DBCz@PMMA进行的肿瘤靶向成像和淋巴系统成像。 (f) 切除肿瘤组织的组织学H&E染色。在图(b,d)中，数据以均值±标准差表示（n=3个生物学重复）。P值通过t检验（非配对，双尾）确定。
总结与展望
本研究提出了一种基于内源耗氧的乳液聚合纳米球策略，为实现环境空气条件下的水相室温磷光提供了可行途径。该水相磷光探针通过将具有高效活性氧生成能力的发光分子封装到经乳液聚合制备的聚甲基丙烯酸甲酯纳米球中构建而成，其致密疏水结构与发光分子的高效活性氧生成能力协同作用，有效抑制了水和氧气对磷光的淬灭。与广泛采用的纳米晶和超分子组装策略相比，该方法克服了晶体依赖发光和严格基质兼容性的限制，特别适用于那些无法通过结晶或超分子组装实现室温磷光、但可在聚合物基质中实现磷光发射的发光分子。研究团队成功展示了这些纳米球在皮下组织、肿瘤和淋巴组织生物成像中的应用效果，信号与背景比最高达到556。这项新策略将有效缓解当前有机室温磷光材料用于生物成像的发展瓶颈——水相室温磷光材料构建策略的匮乏，有望推动多样化水相室温磷光材料的开发及其在生物医学领域的应用。
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