2026年1月22日，清华大学药学院/膜生物学国家重点实验室尹航、蒋云瑶团队联合上海中医药大学徐英团队、上海中医药大学附属曙光医院等，在International Journal of Biological Sciences（中科院1区，IF=10.0）在线发表题为 “Rubimaillin ameliorates liver fibrosis by triggering the ferroptosis of activated hepatic stellate cells through targeting CPT1A” 的研究论文。该研究聚焦肝纤维化进展中活化肝星状细胞（HSCs）铁死亡不足与代谢重编程异常这一关键问题，首次系统揭示中药茜草来源天然产物 Rubimaillin（Rub）可直接靶向 CPT1A，诱导活化 HSCs 发生铁死亡，从而显著改善肝损伤与肝纤维化，为肝纤维化治疗提供了新的天然产物候选物和潜在分子靶点。
▼编者按:
肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化、肝衰竭甚至肝癌进展的共同病理基础，其核心特征是细胞外基质异常沉积和肝脏结构破坏。目前临床上针对肝纤维化仍缺乏获批的特异性抗纤维化药物，治疗主要依赖病因控制，如抗病毒、戒酒、减重和改善代谢紊乱等。因此，寻找能够直接干预纤维化进程的新靶点和新药物具有重要意义。
肝星状细胞是肝纤维化发生发展的关键效应细胞。正常情况下，HSCs处于静息状态，主要负责储存维生素A；当肝脏长期受损时，HSCs被激活并转化为肌成纤维细胞样细胞，表现出增强的增殖、迁移、收缩和细胞外基质分泌能力。近年来研究表明，诱导活化HSCs发生铁死亡，可以抑制其异常增殖和胶原沉积，被认为是抗肝纤维化的重要策略。与此同时，CPT1A作为脂肪酸氧化的限速酶，参与细胞能量代谢重编程，并与HSCs活化和铁死亡抵抗密切相关，因此具有重要的治疗靶点价值。
本研究中，作者首先在TGF-β1诱导的LX2和JS1细胞模型中发现，Rub可浓度依赖性抑制HSCs活化，降低α-SMA、Col1A1等纤维化标志物表达。随后，在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型中，Rub显著降低血清ALT、AST水平，改善肝组织病理损伤，减少Masson和Sirius red染色所示的胶原沉积，并降低α-SMA、Col1A1、Col3A1和TGF-β1等纤维化相关指标，提示Rub具有明确的抗肝损伤和抗纤维化作用。
为进一步解析其机制，研究团队通过RNA-seq发现Rub处理后谷胱甘肽代谢和铁死亡通路显著富集，提示铁死亡可能是Rub抗肝纤维化的核心机制。后续实验进一步证实，Rub可增强活化HSCs中ACSL4表达，降低GPX4水平，并引起GSH减少、GSSG升高、脂质过氧化、ROS和Fe²⁺积累，以及线粒体缩小、嵴减少等典型铁死亡特征。值得注意的是，Rub主要诱导活化HSCs铁死亡，而对肝细胞、巨噬细胞和肝窦内皮细胞的铁死亡影响相对有限，体现出一定的细胞选择性。
在靶点发现方面，作者利用PROTAC靶点捕获技术筛选Rub的直接作用蛋白，并将CPT1A确定为关键候选靶点。进一步通过分子动力学模拟、CETSA、DARTS、BLI和位点突变实验证实，Rub可直接结合CPT1A，并通过SER592、THR594和THR689等关键位点抑制CPT1A活性。CPT1A敲低或过表达均可削弱Rub诱导HSCs铁死亡的作用，说明CPT1A是Rub发挥抗纤维化效应的关键靶点。
机制上，Rub通过靶向CPT1A调控c-Myc泛素化，进而影响NRF2/GPX4抗氧化系统和ACSL4/PL-PUFAs脂质过氧化通路，最终推动活化HSCs发生代谢重编程介导的铁死亡。换言之，Rub并非单纯抑制HSCs活化，而是通过“靶向CPT1A—重塑脂肪酸代谢—削弱抗氧化防御—增强脂质过氧化—诱导铁死亡”这一连续机制，从源头上限制纤维化效应细胞的病理功能。
综上，该研究不仅阐明了Rubimaillin抗肝纤维化的药效基础，还揭示了其直接靶点CPT1A及其介导的铁死亡调控机制。该发现拓展了天然产物干预肝纤维化的研究思路，也为“靶向活化HSCs铁死亡”这一治疗策略提供了新的实验依据。未来，若能在HSCs特异性CPT1A敲除动物模型和更接近临床病因的肝纤维化模型中进一步验证，将有望推动Rub及CPT1A靶向策略向抗肝纤维化药物开发迈进。
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【摘要】
肝纤维化是指由于慢性肝损伤导致细胞外基质蛋白在肝脏中过度积累。靶向诱导活化肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）发生铁死亡，被认为是治疗肝纤维化的一种有前景的策略。Rubimaillin（Rub）是从传统中药茜草（Rubia cordifolia L.）中提取的一种萘醌类化合物，在多种疾病中表现出多样的药理活性。本研究旨在探讨 Rub 的抗肝纤维化作用、直接蛋白靶点及其分子机制。
研究结果表明，在小鼠模型中，Rub 可通过触发活化 HSCs 的铁死亡，有效改善肝纤维化。随后，研究者利用 PROTAC 技术、计算机分子动力学模拟、细胞热转移实验（CETSA）、药物亲和反应靶标稳定性实验（DARTS）、生物层干涉技术（BLI）以及位点突变实验，证实 Rub 可直接结合肉碱棕榈酰转移酶 1A（CPT1A）的 SER592、THR594 和 THR689 位点，并抑制其活性。
进一步研究发现，在活化 HSCs 中抑制或缺失 CPT1A 可触发由代谢重编程介导的铁死亡。此外，CPT1A 缺失或过表达均可消除 Rub 诱导铁死亡的作用。从机制上看，Rub 诱导活化 HSCs 铁死亡与其靶向 CPT1A 所介导的代谢重编程有关。综上，本研究阐明了 Rub 通过诱导活化 HSCs 铁死亡改善肝纤维化的有益作用、直接蛋白靶点及分子机制。
关键词：Rubimaillin；肝纤维化；肝星状细胞（HSCs）；铁死亡；肉碱棕榈酰转移酶 1A（CPT1A）。
01
研究背景及科学问题
肝纤维化是多种慢性肝病进展过程中的关键共同病理过程。当肝脏持续受到损伤，例如受到慢性病毒性肝炎（乙型肝炎和丙型肝炎）、酒精性肝病、代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MAFLD）、自身免疫性肝病等致病因素刺激时，肝星状细胞（HSCs）被激活，细胞外基质（ECM）成分的合成增加而降解减少。随后，大量 ECM 在肝组织中异常沉积，逐渐破坏肝脏正常结构，并使肝脏质地变硬，从而形成肝纤维化。
随着生活方式改变，酒精性肝病和 MAFLD 的发生率急剧上升，再加上慢性病毒性肝炎的持续影响，肝纤维化患病率逐年增加。然而，肝纤维化领域仍存在未被满足的临床需求，目前尚无获批用于其治疗的特异性化学药物或生物制剂。现阶段主要治疗方式仍是病因治疗，例如慢性病毒性肝炎患者接受抗病毒治疗，酒精性肝病患者戒酒，MAFLD 患者控制体重并改善代谢紊乱。鉴于现有治疗手段的局限性以及肝纤维化形势日益严峻，亟需寻找新的治疗靶点和候选药物。
肝纤维化的发生并非由单一因素导致，而是多种细胞类型、信号通路和细胞外环境相互交织并协同作用的结果。普遍认为，HSCs 是肝纤维化中的主要效应细胞，其活化是肝纤维化发病机制中的核心事件。在正常肝脏中，HSCs 处于静息状态，主要功能是储存维生素 A 并维持肝脏正常结构。然而，当肝脏遭受持续损伤时，多种刺激信号会破坏 HSCs 稳态，促使其转化为肌成纤维细胞样细胞。活化后的 HSCs 获得了较强的增殖和迁移能力、收缩特性以及分泌细胞因子和 ECM 的能力。值得注意的是，HSCs 的增殖和迁移需要大量能量输入，从而触发细胞代谢重编程。
肉碱棕榈酰转移酶 1A（CPT1A）是一种位于线粒体外膜的酶，可通过将长链脂肪酸转运至线粒体进行 β-氧化来构成脂肪酸氧化的限速步骤，并以 ATP 形式产生能量，在调控细胞能量代谢中发挥重要作用。此外，CPT1A 介导的脂肪酸氧化可通过核苷代谢促进鼻咽癌细胞增殖。已有研究证实，在肝纤维化小鼠模型和肝纤维化患者的 HSCs 中，CPT1A 表达显著升高；升高的 CPT1A 可诱导 HSCs 活化，从而促进肝纤维化进展。相反，在 HSCs 中通过药理或遗传方式抑制 CPT1A，可通过抑制 HSCs 活化来缓解肝纤维化。因此，开发靶向 CPT1A 的化合物可能为肝纤维化治疗开辟新的途径。
铁死亡作为一种新型程序性细胞死亡方式，近年来在肝纤维化研究领域受到广泛关注。与传统的细胞凋亡和坏死不同，铁死亡主要依赖铁过载和脂质过氧化物积累，进而破坏细胞膜结构并触发细胞死亡。多项研究表明，在肝纤维化过程中，细胞内铁代谢失衡、铁离子摄取增加以及储存和输出减少，会导致 HSCs 铁过载，并为铁死亡发生提供条件。研究证实，诱导活化 HSCs 发生铁死亡可显著降低 HSCs 生长、抑制 ECM 积累，从而缓解肝纤维化。因此，诱导活化 HSCs 铁死亡正成为一种新的、有前景的肝纤维化治疗策略。
目前，CPT1A 被认为是铁死亡抵抗的重要驱动因子，阻断 CPT1A 可触发铁死亡。近期研究表明，靶向 CPT1A 介导的代谢重编程可通过两种关键机制诱导铁死亡：一是下调核因子 E2 相关因子 2（NRF2）/谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）抗氧化系统；二是增强长链酰基辅酶 A 合成酶 4（ACSL4）介导的磷脂多不饱和脂肪酸（PL-PUFAs）生成，而这两者均受 c-Myc 泛素化调控。因此，考虑到 CPT1A 在活化 HSCs 以及铁死亡中的作用，作者推测 CPT1A 也可能通过介导代谢重塑来诱导活化 HSCs 铁死亡，从而缓解肝纤维化。简言之，靶向 CPT1A 介导的活化 HSCs 铁死亡具有成为肝纤维化治疗策略的潜力。
目前，针对中药成分和天然产物的靶标捕获技术已有多种。亲和力基础靶标鉴定可通过小分子与蛋白之间的固有亲和力捕获靶标，操作简便，但容易受到非特异性结合事件的干扰；活性基础蛋白质组学分析（ABPP）通过活性探针实现对蛋白活性位点的特异性结合，适用于酶类靶标，但应用范围受限；无标记靶标鉴定可避免标签干扰并重现靶标的生理结合状态，但存在灵敏度低、检测成本高等固有不足。
与这些主要聚焦于“靶标识别与鉴定”的传统靶标捕获技术相比，PROTAC 靶标捕获技术作为一种先进的靶标解析工具，可避免对天然产物进行化学修饰，并能在活细胞生理条件下进行原位靶标捕获，从而克服传统方法的局限。因此，该技术已越来越多地用于中药成分和天然产物的靶标鉴定，为该研究领域提供了新的高效策略。PROTAC 作为近年来发展起来的强大内源性蛋白降解工具，其核心优势不仅在于可特异性结合靶蛋白，还可通过泛素-蛋白酶体系统触发靶蛋白泛素化及后续降解，从而进一步提高靶标鉴定的可靠性。
茜草（Rubia cordifolia L.）的根或根茎是一种传统中药，在中国被广泛用于治疗关节炎、子宫出血和慢性肝病。Rubimaillin（Rub，又称 Mollugin）是从茜草中提取的一种萘醌类化合物，在研究中显示出抗肿瘤、抗炎和神经保护等多种药理活性。此外，有报道显示 Rub 可抑制结直肠癌细胞增殖并驱动铁死亡。然而，Rub 在肝纤维化中的作用仍未得到充分阐明。鉴于 CPT1A 在 HSCs 活化及其铁死亡抵抗中发挥核心作用，同时考虑到 Rub 调控铁死亡的潜力，本研究假设 Rub 可能通过靶向 HSCs 中的 CPT1A 并诱导其铁死亡，从而发挥抗肝纤维化作用。
在本研究中，为评估 Rub 的抗肝纤维化作用，作者建立了转化生长因子 β1（TGF-β1）诱导的 HSCs 活化模型和四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化模型。随后，研究者通过 RNA 测序（RNA-seq）分析探索潜在机制，并通过验证实验证实 Rub 可诱导活化 HSCs 铁死亡。PROTAC、分子对接和结合实验鉴定并验证了 Rub 与 CPT1A 的相互作用。CPT1A 敲低和过表达模型进一步验证了 Rub 诱导铁死亡对 CPT1A 的依赖性。最后，研究者分析了 Rub 对 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路的调控，以阐明其通过靶向 CPT1A 诱导铁死亡的机制。
02
重要发现及亮点
Rub 在体外抑制 HSCs 活化
为评价 Rub 在体外对 HSCs 活化的抑制作用，研究者采用 TGF-β1 诱导人 HSCs 细胞系 LX2 和小鼠 HSCs 细胞系 JS1 的活化。在评价 HSCs 活化之前，首先通过 CCK8 实验检测 Rub 对 LX2 和 JS1 细胞活力的影响。LX2 和 JS1 细胞在有或无 TGF-β1 诱导的条件下，同时接受不同浓度 Rub 处理 48 小时。如图 1A 所示，在 25–300 μM 范围内，Rub 对 LX2 和 JS1 细胞活力表现出不同程度的浓度依赖性抑制作用。显然，Rub 对 TGF-β1 诱导细胞的活力抑制作用更为显著。
进一步分析细胞活力抑制率发现，Rub 对 TGF-β1 刺激的 LX2 和 JS1 细胞抑制率超过 20%（范围：20.94%–31.63%），而对未受 TGF-β1 刺激的 LX2 和 JS1 细胞抑制率低于 20%（范围：2.70%–16.68%），且两种细胞系中 TGF-β1 刺激组与未刺激组之间差异均具有统计学意义（图 1B）。因此，在 50、100 和 150 μM 浓度下，Rub 不会改变静息 HSCs 的细胞活力。
随后，研究者在 50、100 和 150 μM 浓度下评价 Rub 对 HSCs 活化的抑制作用。LX2 和 JS1 细胞经 TGF-β1 诱导活化并与 Rub 共孵育后，采用 qPCR 和 Western blot 检测 HSCs 活化标志物 α-SMA 和 Col1A1。结果显示，Rub 可显著降低 LX2 和 JS1 细胞中 α-SMA 与 Col1A1 的 mRNA 表达，以及 α-SMA 蛋白表达，并呈浓度依赖性抑制（图 1C-D）。此外，研究者还通过免疫荧光检测 α-SMA 和 Col1A1 的表达，结果显示，在 TGF-β1 诱导的 LX2 和 JS1 细胞中，α-SMA 和 Col1A1 阳性染色荧光强度显著增强；而不同浓度 Rub 孵育可明显抑制该荧光增强（图 1E-F）。综上，这些结果证实 Rub 是一种潜在抑制剂，可显著抑制 HSCs 活化。
图 1. Rub对 LX2 和 JS1 细胞中 HSCs 活化的影响。（A）Rub 对 LX2 和 JS1 细胞活力的影响。（B）Rub 对 LX2 和 JS1 细胞活力的抑制率。（C）LX2 和 JS1 细胞中 α-SMA 和 Col1A1 的 mRNA 表达。（D）LX2 和 JS1 细胞中 α-SMA 的蛋白表达。（E）LX2 和 JS1 细胞中 α-SMA（绿色，比例尺 = 100 μm）和 Col1A1（红色，比例尺 = 100 μm）的免疫荧光染色。（F）LX2 和 JS1 细胞中 α-SMA 和 Col1A1 阳性染色的荧光强度。所有实验均进行 n = 3 次独立生物学重复。 < 0.05 vs DMSO；*p < 0.05 vs TGF-β1。
Rub 有效改善 CCl4 诱导小鼠的肝损伤和肝纤维化
为考察 Rub 对肝损伤和肝纤维化的药理作用，研究者通过每周 3 次腹腔注射 15% CCl4、持续 6 周建立小鼠肝纤维化模型，并从第 3 周开始给予 Rub（10 和 20 mg/kg）灌胃处理（图 2A）。实验结束后，依次评价小鼠肝损伤和肝纤维化指标。CCl4 组中升高的血清肝损伤标志物（如 AST 和 ALT 水平）经 Rub 处理后显著降低（图 2B）。
同时，肝组织病理学 H&E 染色结果如图 2C 所示。与对照组相比，CCl4 诱导肝纤维化小鼠的肝组织出现明显组织学改变，包括正常肝小叶结构被破坏、肝细胞肿胀并出现空泡样变性、肝窦间隙变窄、纤维间隔增宽以及肝组织中明显炎性细胞浸润。然而，这些病理改变可被 Rub 处理显著改善。
此外，研究者采用 Masson 染色和 Sirius red 染色评价胶原纤维沉积。在 CCl4 诱导的肝纤维化小鼠中，胶原沉积明显，纤维间隔染色强烈，呈增厚和广泛分布；同时，Masson 阳性面积和 Sirius red 阳性面积均显著升高。Rub 处理后，纤维化小鼠胶原纤维沉积明显减轻（图 2D 和 F）。与此同时，作为胶原代谢重要指标的肝羟脯氨酸（Hyp）含量也被检测，结果显示 Rub 处理后 Hyp 含量明显下降（图 2G）。
HSCs 活化常用于评价体内肝纤维化的发生与发展。因此，本研究也像体外实验一样，通过 qPCR、Western blot 和免疫组织化学检测 HSCs 活化相关指标。结果见图 2E 和 H：免疫组织化学结果显示，CCl4 组 α-SMA 阳性染色明显增加，而 Rub 组显著降低。qPCR 和 Western blot 结果显示，CCl4 诱导小鼠肝组织中升高的 α-SMA 和 Col1A1 mRNA 表达，以及 α-SMA 蛋白表达，均被 Rub 处理显著降低（图 2I-J）。此外，CCl4 组中部分纤维化相关基因 Col1A3 和 TGF-β1 的 mRNA 表达也经 Rub 处理显著降低（图 2I）。这些结果提示，Rub 可抑制 CCl4 诱导小鼠中的 HSCs 活化。值得注意的是，在所有检测参数中，Rub 的治疗效果与阳性对照药物索拉非尼（Sora）相当，甚至更优。总体而言，这些数据表明 Rub 可有效改善 CCl4 诱导小鼠的肝损伤和肝纤维化。
图 2. Rub 对 CCl4 诱导小鼠肝损伤和肝纤维化的影响。（A）CCl4 注射并接受 Rub 或 Sora 治疗小鼠的实验流程示意图。（B）血清 ALT 和 AST 活性。（C）H&E 染色（比例尺 = 100 μm 和 50 μm）。（D、F）Masson 和 Sirius red 染色（比例尺 = 100 μm）及其半定量分析。（E、H）α-SMA 免疫组织化学染色（黄褐色，比例尺 = 100 μm）及其半定量分析。（G）肝脏 Hyp 含量。（I）α-SMA、Col1A1、Col3A1 和 TGF-β1 的 mRNA 表达。（J）α-SMA 的蛋白表达。n = 6， < 0.05 vs Control；*p < 0.05 vs CCl4。
RNA-seq 分析显示 Rub 调控铁死亡通路
为探索 Rub 抗肝纤维化作用的分子机制，研究者对经 Rub 处理或未处理的纤维化肝组织进行 RNA-seq 分析。差异表达基因火山图分析显示，Rub-vs-CCl4 组的基因表达谱发生整体变化，共富集到 722 个下调基因和 1034 个上调基因（图 3A）。在 KEGG 通路分析中，谷胱甘肽代谢和铁死亡通路显著富集（图 3B）。
进一步采用基因集富集分析（GSEA）对这两个通路进行分析，其 NES、P 值和 FDR 分别为：谷胱甘肽代谢（NES = -2.52，p < 0.001，FDR < 0.001）和铁死亡（NES = -2.28，P < 0.001，FDR = 0.0）（图 3C），提示这两个通路在 GSEA 中同样显著富集。谷氨酸代谢参与铁死亡并与该过程密切相关。铁死亡通路差异表达基因热图如图 3D 所示；例如，经 Rub 处理后，Hmox1、Slc7a11 和 Gclc 表达显著降低，而 Acsl3、Acsl4 和 Acsl5 表达显著升高。综上，Rub 可在肝纤维化中显著诱导铁死亡，这可能是 Rub 抗肝纤维化作用的潜在分子机制。
图 3. 基于 RNA-seq 分析的 Rub 对铁死亡通路的影响。（A）火山图显示 mRNA 转录水平的 log2 倍数变化。（B）KEGG 通路富集分析（前 20 位）。（C）谷胱甘肽代谢和铁死亡通路的 GSEA 分析。（D）基于 GSEA 分析的铁死亡通路相关基因表达谱热图。
Rub 诱导活化 HSCs 发生铁死亡
为确定 Rub 诱导铁死亡发生于哪一类肝细胞，研究者评价了 Rub 对 HSCs、巨噬细胞、肝窦内皮细胞和肝细胞铁死亡的影响。考虑到 HSCs 是介导肝纤维化的关键效应细胞，且越来越多证据表明诱导活化 HSCs 铁死亡是治疗肝纤维化的有效措施，研究者首先评价 Rub 是否可诱导活化 HSCs 铁死亡。在本研究中，在 Rub 处理的 CCl4 诱导小鼠中观察到活化 HSCs 的 Rub 诱导铁死亡。具体而言，免疫荧光染色结果显示，在 Rub 处理的纤维化小鼠中，铁死亡过程正向调控因子 ACSL4 与活化 HSCs 标志物 α-SMA 的共染显著上调（图 4A 和 B）。
随后，研究者开展一系列实验，在体外评价 Rub 对活化 HSCs 铁死亡的影响。首先，将 TGF-β1 诱导的 LX2 和 JS1 细胞与 Rub 及 Fer-1（一种铁死亡抑制剂）共同孵育，结果显示 Fer-1 可消除 Rub 对细胞活力的抑制作用（补充材料图 S1A）。已有研究证实，在铁死亡过程中，细胞线粒体的形态学变化表现为线粒体体积减小、双层膜密度增加以及线粒体嵴减少或消失。结果如图 4C 和补充材料图 S1B 所示，在 Rub 处理的活化 LX2 和 JS1 细胞中观察到与铁死亡相关的线粒体形态改变。
与此同时，Rub 处理的活化 LX2 和 JS1 细胞中也出现了其他重要铁死亡指标的变化，表现为 GSH 含量下降，GSSG、LPO、ROS 和 Fe2+ 水平升高（图 4D-E 和补充材料图 S1C-D）。此外，Rub 处理可显著下调 GPX4 蛋白水平，并显著上调 ACSL4 蛋白水平（补充材料图 S1E）。研究者还评价了 Rub 对 HSCs 凋亡或坏死（两种最常见的替代性细胞死亡方式）的影响，结果显示 Rub 并未显著调控 HSCs 的这两类细胞死亡（补充材料图 S2）。这些结果提示 Rub 可诱导 HSCs 发生铁死亡。
根据铁死亡关键指标 ACSL4 的免疫荧光结果可知，在肝纤维化中，Rub 主要调控纤维间隔间质细胞中这些蛋白的表达，提示 Rub 诱导的肝细胞铁死亡主要发生于间质细胞。因此，研究者进一步评价 Rub 对巨噬细胞和肝窦内皮细胞铁死亡的影响。结果显示，Rub 处理组中 ACSL4 与 CD11b（肝 Kupffer 细胞标志物）和 CD34（肝窦内皮细胞标志物）的免疫荧光共染极少，与 CCl4 模型组相比无显著差异（补充材料图 S3A-B）。此外，研究者还在体外评价 Rub 对肝细胞铁死亡的影响，结果显示 Rub 不会促进肝细胞系 AML12 细胞发生铁死亡（补充材料图 S4）。综上，上述结果证实，在肝纤维化中 Rub 可诱导活化 HSCs 发生铁死亡。
图 4. Rub 对活化 HSCs 铁死亡的影响。（A）CCl4 诱导小鼠肝切片中 ACSL4（绿色）和 α-SMA（红色）的免疫荧光共染（比例尺 = 100 μm）。（B）ACSL4 和 α-SMA 共染的半定量分析。（C）TGF-β1 诱导的 LX2 细胞线粒体超微结构变化（比例尺 = 200 nm）。（D、E）TGF-β1 诱导的 LX2 细胞中 LPO、ROS 和 Fe2+ 的荧光染色（比例尺 = 100 μm）。所有实验均进行 n = 3 次独立生物学重复。 < 0.05 vs Control；*p < 0.05 vs CCl4 或 TGF-β1。
CPT1A 是 Rub-PROTAC 的降解靶标
为研究 Rub 在抗肝纤维化中的靶点，研究者采用 PROTAC 靶标捕获技术在 LX2 细胞中鉴定其靶标。首先，选择 Rub 合成 PROTAC 分子。为合成 Rub 的 PROTAC，研究者选取活性最强的 Rub 核心骨架结构作为目标蛋白（POI）配体，并将 Rub 与连接至沙利度胺的 1-聚乙二醇（1-PEG）连接子偶联，获得 PROTAC 分子（称为 Rub-PROTAC）（图 5A 和补充材料方案 S1）。与此同时，Rub-PROTAC 对 TGF-β1 刺激 LX2 细胞中 α-SMA 蛋白表达也表现出显著抑制活性（图 5B）。
为研究直接而非间接蛋白降解，LX2 细胞仅用 Rub-PROTAC 和 DMSO 处理 10 小时；随后采用 4D-DIA 蛋白质组学分析 Rub-PROTAC 显著降解的蛋白（图 5C）。如图 5D 和 E 所示，一些蛋白显著下调，如 ZC3H11A、CPT1A、PDCD11、ABCF3 和 COPB2。在这些蛋白中，已有研究报道 CPT1A 对肝纤维化发展和铁死亡过程至关重要。在肝纤维化中，CPT1A 缺失可缓解 HSCs 活化和肝纤维化。此外，已有研究表明 CPT1A 缺乏可诱导肺癌细胞发生铁死亡。结合分析结果与 Rub 的药理作用，研究者最终将研究重点集中于 CPT1A。
为验证蛋白质组学分析结果，研究者将 LX2 和 JS1 细胞与不同浓度 Rub-PROTAC 共孵育 10 小时。结果显示，Rub-PROTAC 以浓度依赖性方式增强 CPT1A 泛素化（Ub-CPT1A），并以浓度依赖性方式降解 CPT1A 蛋白（图 5F）。随后，研究者将经 Rub-PROTAC 处理的细胞与泛素化抑制剂 MG132 共孵育，结果显示 MG132 可消除 Rub-PROTAC 介导的 Ub-CPT1A 增强和 CPT1A 蛋白降解（图 5G）。进一步地，研究者在 LX2 和 JS1 细胞中同时共孵育 Rub 和 Rub-PROTAC，以评价是否存在对 CPT1A 的竞争性结合。结果显示，Rub 可部分逆转 Rub-PROTAC 对 CPT1A 蛋白的降解作用（图 5H）。总之，上述结果证实 Rub-PROTAC 通过泛素化通路降解 CPT1A 蛋白，且 CPT1A 可能是 Rub 的结合靶标。
图 5. 利用 PROTAC 技术在 LX2 细胞中分析并确定 Rub 靶蛋白。（A）Rub 探针与 PROTAC 分子（Rub-PROTAC）的合成。（B）Rub 和 Rub-PROTAC 处理 LX2 细胞后 α-SMA 的蛋白表达。（C）基于 4D-DIA 蛋白质组学分析的靶标鉴定流程。（D）差异蛋白火山图。（E）log2FoldChange < -1 的降解蛋白。（F）Rub-PROTAC 处理 LX2 和 JS1 细胞中 CPT1A 蛋白的浓度依赖性泛素化与降解。（G）MG132 和 Rub-PROTAC 处理 LX2 和 JS1 细胞中 CPT1A 蛋白的泛素化与降解。（H）Rub-PROTAC 与 Rub 共处理 LX2 和 JS1 细胞 10 小时后 CPT1A 的蛋白水平。所有实验均进行 n = 3 次独立生物学重复。 < 0.05 vs DMSO；*p < 0.05 vs TGF-β1 或 Rub-PROTAC。
Rub 在 HSCs 中直接靶向 CPT1A
为确认 CPT1A 是 Rub 的直接靶点，研究者首先选择 CPT1A-Rub 复合物和 CPT1A 进行分子动力学模拟，以评价 Rub 与 CPT1A 的结合。在整个模拟过程中（200 ns），CPT1A 的 Cα 主链均方根偏差（RMSD）基本稳定在 3 Å，说明该系统在模拟过程中达到平衡状态。CPT1A-Rub 复合物的 Cα 主链 RMSD 从模拟初期升至 6 Å，随后在模拟中期降至 5 Å，并在模拟后期稳定维持在 5 Å 以下，提示该结合构象具有较高热力学稳定性（图 6A）。
从均方根波动（RMSF）结果可见，CPT1A 活性位点氨基酸残基的 RMSF 基本低于 2.0–2.5 Å，提示 CPT1A-Rub 的配体结合可稳定活性位点的局部构象（图 6B）。同时，研究者还监测了 CPT1A-Rub 系统中的氢键数量、旋转半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）变化（图 6C-E）。这些结果进一步表明，Rub 在整个模拟过程中可稳定结合 CPT1A；CPT1A-Rub 的氢键数量保持稳定，且氢键结合位点也一致。此外，自由能景观（FEL）分析显示，PC1(20)/PC2(-20) 是一个低能量凹陷，提示此时 Rub 和 CPT1A 的构象稳定（图 6F）。这些数据表明 Rub 可在整个模拟过程中稳定结合 CPT1A。
随后，研究者分别采用细胞热转移实验（CETSA）、药物亲和反应靶标稳定性（DARTS）实验和生物层干涉（BLI）实验评价 Rub 与 CPT1A 的结合能力。在 CETSA 实验中，Rub 明显提高 LX2 和 JS1 细胞中 CPT1A 蛋白的细胞热稳定性（图 6G）。在 DARTS 实验中，Rub 孵育后 LX2 和 JS1 细胞中 CPT1A 的降解显著减少（图 6H）。在 BLI 实验中，Rub 与 CPT1A 的平衡解离常数（KD）为 3.77E-04 mol/L（图 6I）。此外，研究者评价了 Rub 对 CPT1A 活性的影响，发现 Rub 可显著抑制 LX2 和 JS1 细胞中的 CPT1A 活性（图 6J 和补充材料图 S5A）。
进一步地，研究者进行分子对接模拟以研究 Rub-CPT1A 复合物的结合模式。结果显示，Rub 可能与 CPT1A 的 SER592、THR594 和 THR689 形成氢键网络（图 6K）。最后，在 shRNA 介导内源性 CPT1A 敲低的 LX2 细胞中，将 SER592、THR594 和 THR689 系统性突变为丙氨酸，并随后过表达野生型 CPT1A。结果发现，这些位点突变显著削弱了 Rub 对 CPT1A 活性的抑制作用，提示 SER592、THR594 和 THR689 是 Rub 抑制 CPT1A 活性的关键结合位点（图 6L）。
为评价 Rub 相较其他肝细胞类型对 HSCs 的特异性，研究者在 150 μM 浓度下检测 Rub 对 TGF-β1 活化 LX2 细胞、正常小鼠肝细胞（AML12）、LPS 极化小鼠骨髓来源巨噬细胞（iBMDM）以及 VEGF 刺激的人肝窦内皮细胞（HHSEC）中 CPT1A 活性的影响，并比较不同细胞间的活性抑制率。结果显示，Rub 在 LX2 细胞中对 CPT1A 活性的抑制效率显著高于 AML12、iBMDM 和 HHSEC 细胞（补充材料图 S5B-C）。同时，研究者检测了 Rub 处理后肝组织中 CPT1A 的表达，结果显示 Rub 可显著降低 CCl4 诱导肝纤维化中的 CPT1A 蛋白水平（补充图 S5D）。综上，这些结果提示 CPT1A 是 Rub 在 HSCs 中的直接药理靶点。
图 6. Rub 直接靶向 CPT1A 的验证。（A）采用均方根偏差（RMSD）评价 Rub-CPT1A 结合稳定性。（B）均方根波动（RMSF）。（C）模拟过程中的氢键数量。（D）旋转半径（Rg）。（E）溶剂可及表面积（SASA）。（F）自由能景观（FEL）分析。（G、H）采用 CETSA 和 DARTS 实验检测 LX2 和 JS1 细胞中 CPT1A 的蛋白水平。（I）BLI 实验中 Rub 与 CPT1A 的结合动力学。（J）Rub 对 LX2 细胞中 CPT1A 活性的影响。（K）Rub 与 CPT1A 之间的分子对接模拟。（L）位点突变 LX2 细胞中 Rub 对 CPT1A 活性的影响。所有实验均进行 n = 3 次独立生物学重复。 < 0.05 vs Ctr 或 DMSO；*p < 0.05 vs TGF-β1 或 Rub-PROTAC。
Rub 通过靶向 CPT1A 诱导活化 LX2 细胞发生铁死亡
基于此前关于 CPT1A 缺失可在肝纤维化过程中缓解 HSCs 活化，并可在肿瘤细胞中诱导铁死亡的报道，研究者推测 CPT1A 同样在诱导活化 HSCs 铁死亡中发挥作用。为验证这一假设，研究者进行了 CPT1A 活性抑制剂 Etomoxir 处理和 CPT1A 敲低实验，以探讨 CPT1A 在 TGF-β1 诱导 LX2 细胞中诱导铁死亡的作用。首先，LX2 细胞用不同浓度 Etomoxir 培养 48 小时；结果显示，在无 TGF-β1 刺激的 LX2 细胞中，Etomoxir 对细胞活力无抑制作用，但在 50 和 100 μM 浓度下对 TGF-β1 刺激的 LX2 细胞活力具有显著抑制作用，尤其在 100 μM 时，细胞活力低于 80%（补充图 S6A）。然而，Fer-1 可消除 Etomoxir 介导的 LX2 细胞生长抑制（补充图 S6B）。
随后，研究者观察到明显的铁死亡线粒体形态学改变；在 TGF-β1 刺激的 Etomoxir 处理 LX2 细胞中，NADPH 和 GSH 含量显著下降，GSSG、LPO、ROS 和 Fe2+ 水平显著升高（补充图 S6C-E）。此外，在 TGF-β1 诱导的 Etomoxir 处理 LX2 细胞中，ACSL4 蛋白表达显著升高，而 GPX4 蛋白表达显著降低（补充图 S6F）。如预期，在 TGF-β1 诱导的 LX2 细胞中，CPT1A 敲低结果与 Etomoxir 处理结果一致（补充图 S6C-F）。
此外，磷脂是构成细胞膜脂质双层的基本成分，可根据其头基分为磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酸（PA）。PL-PUFAs 是脂质过氧化的主要底物，由 ACSL4 生成，被认为是铁死亡的驱动因素。因此，研究者进行了非靶向脂质组学以分析 PL-PUFAs 的代谢状态。结果显示，在转染 shCPT1A 的 LX2 细胞中，PL-PUFAs 水平升高，尤其是 PC-PUFAs、PE-PUFAs 和 PI-PUFAs（补充图 S6G）。总之，这些数据提示阻断 CPT1A 可诱导由代谢重编程介导的活化 HSCs 铁死亡。
为验证 Rub 诱导活化 HSCs 铁死亡是否由靶向 CPT1A 介导，研究者进行 CPT1A 敲低实验，以探索 CPT1A 在 TGF-β1 诱导 LX2 细胞中 Rub 诱导铁死亡中的作用。如图 7A-E 所示，在 TGF-β1 刺激的 LX2 细胞中，Rub 可明显诱导铁死亡线粒体形态变化，显著降低 NADPH 和 GSH 含量，升高 GSSG、LPO、ROS、Fe2+ 和 PL-PUFAs 水平，同时增加 ACSL4 蛋白表达并抑制 GPX4 蛋白水平。随后，研究者将靶向 CPT1A 的 shRNA 转染入 TGF-β1 诱导的 LX2 细胞，再进行 Rub 孵育。结果显示，加入 shCPT1A 后，Rub 诱导铁死亡的显著变化被明显消除（图 7A-F）。换言之，Rub 未能进一步加重 shCPT1A 转染 LX2 细胞中的铁死亡。
此外，研究者还评价了 CPT1A 过表达对 Rub 诱导铁死亡的影响。与 CPT1A 敲低结果类似，CPT1A 过表达同样消除了 Rub 在 LX2 细胞中诱导铁死亡的作用（补充材料图 S7A-D）。这些数据表明，CPT1A 敲低和 CPT1A 过表达均可消除 Rub 诱导 HSCs 铁死亡的作用。综上，这些结果证明 Rub 的铁死亡诱导效应依赖于 CPT1A 介导的代谢重编程。
图 7. CPT1A 缺失对 Rub 诱导 TGF-β1 诱导 LX2 细胞铁死亡的影响。（A）LX2 细胞中 NADPH、GSH 和 GSSG 水平。（B、C）LX2 细胞线粒体超微结构变化（比例尺 = 200 μm）、LPO、ROS 和 Fe2+ 的荧光染色（比例尺 = 100 μm）。（D）LX2 细胞中 GPX4 和 ACSL4 的蛋白表达。（E、F）LX2 细胞中 PL-PUFAs 水平变化。所有实验均进行 n = 3 次独立生物学重复。*p < 0.05 vs shNC。
Rub 通过靶向 CPT1A 调控 c-Myc 泛素化介导的 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路
接下来，研究者继续探索 Rub 如何通过 CPT1A 在 HSCs 中诱导铁死亡。已有报道显示，靶向 CPT1A 可通过抑制 c-Myc 泛素化，调控 NRF2/GPX4 抗氧化系统和 ACSL4/PL-PUFAs 通路，从而介导代谢重塑并诱导肺癌干细胞铁死亡。结合本研究上述结果，作者假设 Rub 诱导铁死亡与活化 HSCs 中 CPT1A 泛素化介导的 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路密切相关。因此，研究者评价了 Rub 对这些通路的影响。
Western blot 结果显示，Rub 处理的 TGF-β1 诱导 LX2 细胞中 GPX4 和核 NRF2 蛋白水平降低，而 c-Myc 泛素化（Ub-c-Myc）、胞质 NRF2 和 ACSL4 蛋白水平升高（图 8A），并伴随 PL-PUFAs 水平升高（图 7E）。随后，研究者将靶向 CPT1A 的 shRNA 转染入 TGF-β1 诱导的 LX2 细胞，以进一步研究 CPT1A 在 Rub 调控 c-Myc 泛素化以及 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路中的作用。Western blot 结果显示，靶向 CPT1A 的 shRNA 显著消除了 Rub 在 TGF-β1 诱导 LX2 细胞中调控 c-Myc 泛素化以及 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路的能力（图 7E、图 8C 和 D）。总之，研究结果证实，Rub 可通过促进 CPT1A 介导的 c-Myc 泛素化，并调控 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路，在活化 HSCs 中诱导由代谢重编程介导的铁死亡（图 9）。
图 8. Rub 对 LX2 细胞中 c-Myc 泛素化介导的 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路的影响。（A、B）Rub 和 Etomoxir 对 LX2 细胞中 GPX4、ACSL4、核 NRF2、胞质 NRF2、c-Myc 泛素化和 c-Myc 蛋白水平的影响。（C、D）Rub 对 LX2 细胞中 GPX4、ACSL4、核 NRF2、胞质 NRF2、Ub-c-Myc 和 c-Myc 蛋白水平的影响。所有实验均进行 n = 3 次独立生物学重复。*p < 0.05 vs DMSO 或 shNC。
图 9. Rub 通过靶向 CPT1A，在活化 HSCs 中诱导代谢重编程介导的铁死亡，从而改善肝纤维化。在肝纤维化过程中，活化 HSCs 中 CPT1A 升高，可通过增强 NRF2/GPX4 通路介导的抗氧化能力，并抑制 ACSL4 介导的 PL-PUFAs 生成，阻止活化 HSCs 发生铁死亡。经 Rub 处理后，Rub 可通过靶向 CPT1A，在活化 HSCs 中诱导由代谢重编程介导的铁死亡，从而改善肝纤维化；这一过程与 c-Myc 泛素化介导的 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路调控密切相关。
【Citation】:Zhang, D., Tang, Q., He, X., Wen, C., Zhou, F., Wei, X., Wang, Z., Wang, J., Liu, W., Xu, Y., Jiang, Y., & Yin, H. (2026). Rubimaillin ameliorates liver fibrosis by triggering the ferroptosis of activated hepatic stellate cells through targeting CPT1A.International journal of biological sciences, 22(4), 2065–2084.
【贡献】★★★★★
综上，在本研究中，作者讨论并证明 Rub 可在体内和体外通过诱导代谢重编程介导的活化 HSCs 铁死亡，从而有效改善肝纤维化。研究者利用 PROTAC 靶标捕获技术鉴定 CPT1A 为 Rub 的靶点，并通过计算机分子动力学模拟、CETSA、DARTS、BLI 和位点突变实验验证 Rub 可直接结合 CPT1A。
此外，研究者不仅证明 CPT1A 是诱导活化 HSCs 铁死亡的重要调控因子，也证实其是 Rub 诱导铁死亡的关键靶点。进一步结果显示，Rub 通过靶向 CPT1A 在活化 HSCs 中诱导代谢重编程介导的铁死亡，这可能与 c-Myc 泛素化介导的 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路有关。然而，本研究也存在一定局限性，尤其是关于 Rub 通过 CPT1A 介导对 HSCs 的特异性靶向验证，仍需要利用体内 HSCs 特异性 CPT1A 敲除模型进一步确认。
总之，Rub 可通过靶向 CPT1A 诱导代谢重编程介导的活化 HSCs 铁死亡，从而改善肝纤维化，为肝纤维化治疗提供了一种有前景的策略。
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