2026年2月，哈尔滨医科大学药学院、寒地心血管病全国重点实验室兰天团队，联合广东药科大学、中山大学附属第一医院、哈尔滨医科大学附属肿瘤医院、中国科学院上海药物研究所等单位，在British Journal of Pharmacology（中科院2区，2024 Impact Factor=7.7）在线发表题为“Noncanonical function of sphingosine kinase 2 (SPHK2) sustains hepatic triglyceride homeostasis”的研究论文。该文于2025年10月19日投稿，2026年2月10日修回，2026年2月12日接收。
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的核心病理特征之一是肝脏脂质稳态紊乱和甘油三酯（TG）过度积累。既往研究多关注鞘氨醇激酶2（SPHK2）依赖其酶活性产生鞘氨醇-1-磷酸（S1P）后对脂质代谢的调节作用，而本研究进一步提出：SPHK2 还可通过非经典、非酶活性依赖的方式维持肝脏 TG 稳态。
研究发现，在 MASLD 患者和高脂饮食诱导的 MASLD 小鼠脂肪变性肝脏中，肝细胞 SPHK2 表达显著降低。肝细胞特异性敲除 Sphk2 会加重高脂饮食诱导的肝脂肪变性、肝脏和血清 TG 升高、脂滴沉积及肝损伤；相反，肝细胞特异性过表达 SPHK2 可改善高脂饮食诱导的肝脂肪变性，并增强与 TG 分解代谢相关的蛋白和通路。
机制上，SPHK2 可与脂肪甘油三酯脂肪酶 ATGL 结合，抑制 E3 泛素连接酶 COP1 介导的 ATGL 泛素化和蛋白酶体降解，从而稳定 ATGL 蛋白、促进 TG 水解并减轻肝脏脂质积累。进一步研究显示，KLF10 是导致脂肪变性肝细胞中 SPHK2 下调的转录抑制因子；同时，过表达催化失活形式的 SPHK2G212E 仍可减轻饮食诱导小鼠的肝脂肪变性，说明 SPHK2 的肝脏保护作用并不完全依赖其酶活性。
该研究揭示了 SPHK2 调控肝脏甘油三酯稳态的新机制，即通过非酶学功能稳定 ATGL、促进 TG 水解，从而缓解 MASLD 相关肝脂肪变性。这一发现不仅拓展了对 SPHK2 生物学功能的认识，也提示 SPHK2 及其非酶学功能可能成为 MASLD 干预的新方向。
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【摘要】
背景与目的：由脂质稳态紊乱引起的肝脂肪变性，是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD）发生发展的重要环节。鞘氨醇激酶 2（sphingosine kinase 2，SPHK2）是鞘脂分解代谢中的关键调节因子，参与肝脏脂质积累。近年来，SPHK2 的非酶学调控作用受到越来越多关注。本研究旨在阐明 SPHK2 在不依赖其酶活性的情况下，介导肝脂肪变性的非经典机制。
实验方法：研究者通过分析 MASLD 小鼠肝细胞单细胞转录组数据，确认 SPHK2 参与肝脂肪变性进展。随后，研究者利用肝细胞特异性过表达或敲除 Sphk2 的小鼠，开展 SPHK2 功能获得与功能缺失实验。研究还结合多组学分析和免疫沉淀-质谱技术，进一步解析 SPHK2 在脂肪变性肝脏中的作用及分子机制。同时，研究者使用 8 型腺相关病毒（adeno-associated virus 8，AAV8）载体，在小鼠体内过表达催化失活形式的 SPHK2。
关键结果：在 MASLD 患者和小鼠的脂肪变性肝脏中，肝细胞 SPHK2 显著下调。肝细胞特异性敲除 Sphk2 会通过抑制脂肪甘油三酯脂肪酶/含 patatin 样磷脂酶结构域蛋白 2、三酰甘油脂肪酶（adipose triglyceride lipase/patatin like domain 2, triacylglycerol lipase，ATGL）介导的甘油三酯水解，促进饮食诱导的肝脂肪变性；相反，肝细胞中过表达 SPHK2 可通过稳定 ATGL，减轻高脂饮食（high-fat diet，HFD）诱导的肝脂肪变性。机制上，SPHK2 可与 ATGL 结合，抑制组成型光形态建成蛋白 1 同源物（constitutive photomorphogenesis protein 1 homolog，COP1）介导的 ATGL 泛素化。此外，研究还发现 Kruppel 样因子 10（Kruppel-like factor 10，KLF10）是导致肝细胞中 SPHK2 下调的转录抑制因子。过表达 SPHK2 的非催化功能可预防饮食诱导小鼠的肝脂肪变性。
结论与意义：SPHK2 可不依赖其酶活性，通过抑制 ATGL 泛素化并促进甘油三酯水解，减轻肝脂肪变性，提示其在 MASLD 干预中具有潜在治疗价值。
01
研究背景及科学问题
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）及其严重亚型代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH），已成为全球慢性肝病的主要原因。如果缺乏有效干预，MASLD 患者可能进一步进展为肝硬化和肝细胞癌。尽管 MASLD 具有重要临床意义，但驱动其进展的分子通路仍未被完全阐明。
肝脏脂质过度积累是 MASLD 的典型特征。这种脂质异常沉积不仅与进展性肝病相关，也与肥胖、2 型糖尿病和心血管疾病密切联系。当肝脏摄入的基础碳水化合物和脂肪酸超过其代谢能力时，异位脂肪沉积便可能发生。尽管过去几十年临床和实验研究不断增加，开发 MASLD 的有效治疗干预手段仍然具有挑战性。Resmetirom（MGL-3196）被设计用于改善肝脏脂肪代谢并减少脂毒性损伤，其 2 期和 3 期临床试验结果显示，resmetirom 治疗可在 MASLD 中带来显著改善，包括 MASH 缓解和肝纤维化降低。这些发现提示，调控肝脏脂肪代谢可能是 MASLD 治疗的重要策略。
在 MASLD 的发病过程中，肝内甘油三酯（triglyceride，TG）过度积累导致的脂毒性是主要特征。过量 TG 积累会使肝细胞更易受到后续损伤，从而加重肝损害。尽管诱发肝脂肪变性的因素很多，脂解功能障碍被认为是推动 MASLD 进展的重要因素。脂肪甘油三酯脂肪酶/含 patatin 样磷脂酶结构域蛋白 2、三酰甘油脂肪酶（ATGL）能够在脂滴中催化 TG 裂解为二酰甘油。肝细胞 ATGL 缺乏会加重小鼠肝脂肪变性进展，而 ATGL 过表达可增强脂肪酸动员和 β-氧化，从而改善脂质积累。近期研究还发现，ATGL 在 PNPLA3（I148M）介导的肝脂肪变性中发挥关键作用。这些结果表明，ATGL 可能是 MASLD 的潜在治疗靶点。
鞘氨醇激酶 2（SPHK2）是鞘脂代谢中的关键酶。肝脏 SPHK2 缺乏可通过鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）/S1P1-5 受体轴加重胰岛素抵抗和糖耐量受损。调节 SPHK2 表达也被认为可能用于脂质紊乱干预。已有研究显示，在酒精性肝病小鼠中，SPHK2 缺乏会加重肝损伤和脂肪变性。此外，SPHK2 还被报道可通过影响极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）分泌或破坏氧化还原平衡来调节肝脂肪变性。值得注意的是，这些调控作用均依赖 SPHK2 的酶活性。
近期，作者团队还发现，SPHK2 可在不依赖其激酶活性的情况下，调节造血干细胞扩增和哺乳动物心脏再生。然而，SPHK2 是否通过调控 ATGL 介导的 TG 水解来影响肝脂肪变性，以及这一过程是否依赖其酶活性，目前仍不清楚。
已有认识包括：肝脂肪变性是 MASLD 的重要病因之一；SPHK2 催化产生的 S1P 已被证明可维持肝脏 VLDL 分泌和氧化还原平衡。本研究进一步补充了两个关键点：SPHK2 可不依赖其酶活性，保护机体免受饮食诱导的肝脂肪变性；SPHK2 通过抑制 COP1 介导的 ATGL 泛素化和降解，促进 TG 水解。从临床意义上看，SPHK2 可能成为 MASLD 治疗的潜在靶点，而 SPHK2 的非酶学功能也拓宽了 MASLD 相关 SPHK2 抑制剂的筛选范围。
在本研究中，作者证明 SPHK2 对肝脂肪变性具有负向调控作用。肝细胞特异性 Sphk2 敲除可促进 HFD 诱导的肝脂肪变性，而肝细胞特异性 SPHK2 过表达可抵抗 HFD 诱导的肝脂肪变性。SPHK2 可不依赖其酶活性，竞争性结合 ATGL，并抑制 COP1 介导的泛素化，从而加速 TG 水解并改善肝脏脂质积累。本研究揭示了 SPHK2 减轻肝脂肪变性的一种新的酶活性非依赖机制，也提示 SPHK2 在 MASLD 治疗中的潜在应用价值。
02
重要发现及亮点
SPHK2在脂肪变性肝脏中显著降低
为探究 SPHK2 在肝脏中的潜在作用，研究者首先分析了公开的小鼠肝脏单细胞转录组数据集 GSE166504，发现 Sphk2 主要表达于肝细胞，而非非实质细胞。这提示 SPHK2 可能参与肝脏中的多种关键生物学过程。
为进一步考察肝脏 SPHK2 在脂肪变性肝脏中的潜在作用，研究者分析了另一个 RNA-seq 数据集 GSE182365，该数据集来源于正常饲料或高脂饮食喂养小鼠的肝细胞。分析共识别出 4 个肝细胞簇，其中 Sphk2 在 Cluster 2 中显著富集，并在 HFD 小鼠中明显下调。此外，Cluster 2 富集了与脂质代谢相关的信号通路。
组织学和免疫荧光染色显示，脂肪变性肝组织样本中 SPHK2 表达降低。与此一致，在 MASLD 患者和 HFD 小鼠肝脏中，Sphk2 的蛋白和 mRNA 水平均显著下降。为进一步明确 SPHK2 表达为何在脂肪变性肝脏中降低，研究者分离原代肝细胞，并用棕榈酸处理以模拟肝脏脂毒性。结果显示，棕榈酸可时间依赖性降低 SPHK2 蛋白丰度；不同剂量棕榈酸处理肝细胞后，SPHK2 表达也呈剂量依赖性下降。这些结果提示，在代谢应激状态下，肝细胞中的 SPHK2 会被下调。
图1：肝脏鞘氨醇激酶 2（SPHK2）在代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）患者和小鼠中显著下调。（a）UMAP 图展示来自 NCBI 数据库 GSE166504 的小鼠肝脏单细胞转录组图谱中的不同细胞簇。（b）气泡图显示 GEO 数据集 GSE166504 中所有细胞簇内 Sphk2 的相对表达。（c）UMAP 图显示 GEO 数据集 GSE182365 中小鼠肝细胞的不同细胞簇。（d）将各细胞簇中的 Sphk2 表达水平映射到 UMAP 图中。（e）气泡图显示不同细胞簇中 Sphk2 的相对表达。（f）对 GSE182365 中 Cluster 2 进行 GO 富集分析。（g）非 MASLD 和 MASLD 患者肝组织样本的 H&E 染色，以及 SPHK2 与 Alb 的双重免疫荧光染色。比例尺为 50 或 100 μm。（h）非 MASLD 和 MASLD 个体肝脏中 SPHK2 蛋白水平的免疫印迹分析。（i）高脂饮食（HFD）小鼠肝脏中 SPHK2 蛋白水平的免疫印迹分析。（j）MASLD 和非 MASLD 个体肝脏中 SPHK2 mRNA 水平。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 5。*P < 0.05。（k）HFD 小鼠肝脏中 Sphk2 mRNA 水平。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。n 代表独立样本数量。
肝细胞Sphk2缺失加重HFD诱导的肝脂肪变性
为了明确 SPHK2 是否调节肝脏脂质积累，研究者利用 Cre-LoxP 系统构建了肝细胞特异性 Sphk2 敲除小鼠（Sphk2-HKO）。结果显示，Sphk2-HKO 小鼠肝脏中 Sphk2 的蛋白丰度和 mRNA 水平均显著降低，且其原代肝细胞中几乎检测不到 SPHK2 翻译产物。进一步观察发现，Sphk2 缺失显著加重棕榈酸诱导的肝细胞脂质积累，并增加细胞内总 TG 含量。这提示 Sphk2 缺失可促进肝细胞脂质积累。
随后，为进一步评估 SPHK2 是否参与肝脂肪变性，研究者分别给予 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠对照饮食（control diet，CD）或 HFD，持续 20 周。HFD 对 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠体重没有明显影响。然而，与 Sphk2-Flox 小鼠相比，Sphk2-HKO 小鼠出现更严重的肝脂肪变性和肝损伤，具体表现为肝脏重量增加、肝脏和血清 TG 水平升高、肝脏脂滴增多、气球样变性更明显，以及血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平升高。Sphk2-HKO 小鼠还表现出更严重的糖耐量受损和胰岛素抵抗。
为进一步探索肝细胞特异性敲除 Sphk2 如何促进肝脂肪变性，研究者进行了 RNA-seq 分析。无监督主成分分析（principal component analysis，PCA）显示，HFD 喂养的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝脏转录组明显分为两个不同组。GO 和 KEGG 分析显示，与脂肪酸代谢和脂质代谢过程相关的基因在 Sphk2 缺失后显著富集并下调。这提示 Sphk2 缺乏可能通过加重脂质代谢紊乱，促进 HFD 诱导的肝脂肪变性。
为进一步解析 SPHK2 调控脂质代谢的机制，研究者对 HFD 喂养的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝脏样本进行了脂质代谢组学分析。结果显示，肝细胞特异性敲除 Sphk2 可显著改变肝脏脂质代谢物。在这些代谢物中，Sphk2-HKO 小鼠肝脏中的 TG 水平显著升高，而二酰甘油（diacylglycerol，DG）水平明显降低。这些结果提示，肝细胞特异性敲除 Sphk2 可能损害 TG 分解代谢，从而促进肝脂肪变性发生。
图2：肝细胞特异性 SPHK2 缺乏加重高脂饮食（HFD）诱导的甘油三酯积累。（a）实验设计示意图。8 周龄 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠接受 CD 或 HFD 喂养 20 周，以诱导代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）。（b）检测 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠的肝脏与体重比。（c）Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝脏及血清甘油三酯（TG）水平。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。（d）HFD 喂养的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝脏切片 H&E 染色。比例尺为 50 μm。（e）HFD 喂养的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝脏切片油红 O 染色及定量分析。比例尺为 50 μm。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 6–7。*P < 0.05。（f）HFD 喂养的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝脏切片透射电子显微镜分析。比例尺为 3 μm。（g）Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和 AST 活性。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。（h）肝脏脂质代谢组学流程图。（i）HFD 喂养的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝脏脂质代谢组学 PCA 分析。（j、k）HFD 喂养的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝脏中差异脂质水平的火山图（j）和柱状图（k）。（l）Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝脏中的二酰甘油（DG）含量。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。n 代表独立样本数量。
肝细胞SPHK2过表达抑制HFD诱导的肝脂肪变性
前述结果显示，肝细胞 Sphk2 缺失可促进 HFD 诱导的肝脂肪变性。接下来，研究者进一步考察肝脏 SPHK2 过表达是否能够改善 HFD 诱导的肝脂肪变性。研究者通过将 Alb-Cre 小鼠与 STOP-Sphk2 小鼠杂交，构建肝细胞特异性 SPHK2 敲入小鼠（Sphk2-HKI），并以同窝 Loxp 小鼠作为对照。
结果显示，Sphk2-HKI 小鼠肝脏中 Sphk2 的蛋白丰度和 mRNA 水平均显著升高，其原代肝细胞中 SPHK2 蛋白丰度也明显增加。在体外实验中，SPHK2 过表达显著降低棕榈酸诱导的脂质积累和细胞总 TG 含量。普通饮食条件下，Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠之间没有显著差异。随后，研究者给予 Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠 HFD 喂养 20 周。HFD 对两组小鼠体重无明显影响，但 Sphk2-HKI 小鼠对 HFD 诱导的肝脂肪变性表现出抵抗作用，表现为肝脏重量比降低、肝脏和血清 TG 水平下降、肝脏脂滴减少，以及血清 ALT 和 AST 活性降低。此外，肝脏 SPHK2 过表达还显著缓解 HFD 诱导的糖耐量受损和胰岛素抵抗。这些结果表明，肝脏 SPHK2 过表达可改善 HFD 诱导的肝脂肪变性。
研究者进一步分析 SPHK2 过表达对 HFD 诱导肝脂肪变性的保护作用是否与 TG 分解代谢改善有关。蛋白质组学结果显示，在 HFD 喂养的 Sphk2-HKI 小鼠肝脏中，SPHK2 过表达可激活与脂质分解代谢和 TG 稳态相关的蛋白及通路。这提示 TG 分解代谢增强可能有助于减轻 Sphk2-HKI 小鼠的 HFD 诱导肝脂肪变性。
此外，为评估肝脏 SPHK2 过表达是否影响基础能量代谢，研究者检测了 HFD 喂养的 Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠的能量消耗和活动水平。结果显示，Sphk2-HKI 小鼠在明暗周期中的能量消耗无显著变化，24 小时监测期间活动水平也与 Loxp 小鼠无显著差异。综合代谢笼实验显示，肝脏 SPHK2 过表达并未改变氧气消耗量（VO₂）或二氧化碳产生量（VCO₂）。这些结果提示，SPHK2 减轻肝脂肪变性的作用不依赖全身能量代谢改变。
图3：肝细胞特异性 SPHK2 过表达改善高脂饮食（HFD）诱导的甘油三酯代谢紊乱。实验设计示意图。（a）8 周龄 Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠经 20 周 HFD 喂养诱导代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）。（b）检测 Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠的肝脏与体重比。（c）Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠肝脏及血清甘油三酯（TG）水平。（d）HFD 喂养的 Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠肝脏切片 H&E 染色。比例尺为 50 μm。（e）HFD 喂养的 Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠肝脏切片油红 O 染色及定量分析。比例尺为 50 μm。（f）Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和 AST 活性。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。（g）肝脏蛋白质组学分析流程图。（h）差异表达蛋白谱的火山图，其中红色表示上调蛋白，蓝色表示下调蛋白。（i）GSEA 显示基于蛋白质组学数据，甘油三酯代谢相关通路发生富集。（j）热图显示与脂质代谢相关的显著改变蛋白。n 代表独立样本数量。
SPHK2不依赖酶活性稳定ATGL并改善肝细胞脂质积累
为进一步研究 SPHK2 影响 TG 降解的机制，研究者对小鼠原代肝细胞的共免疫沉淀-质谱数据进行分析，结果提示 SPHK2 可能与 ATGL（基因名 PNPLA2）相互作用。随后研究发现，SPHK2 可在原代肝细胞和 293T 细胞中与 ATGL 共免疫沉淀。值得注意的是，ATGL 过表达能够有效逆转 Sphk2 缺乏导致的细胞脂质积累和 TG 水平升高，提示 ATGL 表达下降是 Sphk2-HKO 小鼠肝脏脂质积累的关键因素。
既往研究显示，SPHK2 介导的 S1P 生成可缓解 MASLD。SPHK2（G212E）突变体已被证明无法生成 S1P。为明确 SPHK2 是否通过 S1P 依赖性通路调控 ATGL 表达，研究者构建了 Flag-Sphk2G212E 突变质粒，并确认其 S1P 生成能力。结果显示，转染 Sphk2WT 和 Sphk2G212E 均可提高 ATGL 蛋白丰度，提示 SPHK2 对 ATGL 的调控不依赖 S1P。
此外，无论在 CD 还是 HFD 条件下，Sphk2-HKO 小鼠肝脏中的 ATGL 蛋白丰度均显著下降，但其 mRNA 水平未发生变化。相反，肝脏中过表达 SPHK2 可上调 ATGL 蛋白丰度，但不影响其 mRNA 水平。这提示 SPHK2 可能参与调控 ATGL 降解。为验证这一假设，研究者分离 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠原代肝细胞，并使用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺（cycloheximide，CHX）处理。结果显示，肝细胞 Sphk2 缺失显著缩短 ATGL 蛋白半衰期，而 SPHK2-WT 或 SPHK2-G212E 过表达均可明显阻止 ATGL 降解。上述结果表明，SPHK2 可部分以酶活性非依赖方式抑制 ATGL 降解，从而减轻肝脏脂质积累。
图4：SPHK2 增强 ATGL 蛋白稳定性，并以不依赖其酶活性的方式减少脂质沉积。（a）在小鼠原代肝细胞中发现 SPHK2 相互作用蛋白的示意图。（b）质谱（MS）分析中由 SPHK2 拉下的 ATGL 二级峰图。（c–f）Co-IP 实验证明外源性 ATGL 与 SPHK2 在小鼠原代肝细胞和 293T 细胞中存在相互作用。（g）在感染 Myc-ATGL 的 Sphk2-HKO 和 Sphk2-Flox 小鼠原代肝细胞中，经棕榈酸（PA）诱导后进行油红 O 染色及定量分析。比例尺为 20 μm。（h）PA 处理后，从 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠分离并感染 Myc-ATGL 的肝细胞中甘油三酯（TG）浓度。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 5。*P < 0.05。（i）转染 Flag-Sphk2WT 或 Flag-Sphk2G212E 质粒的 AML12 细胞中 Flag 蛋白水平的免疫印迹分析。（j）探索性数据：采用 LC/MS 检测转染 Flag-Sphk2WT 或 Flag-Sphk2G212E 的 AML12 肝细胞中的 S1P 浓度（n = 4）。当 n < 5 时，未进行统计学分析，结果应视为初步结果。（k）转染 Flag-Sphk2WT 或 Flag-Sphk2G212E 质粒的 PA 诱导 AML12 细胞中 SPHK2 和 ATGL 蛋白水平的免疫印迹分析。（l）CD 或 HFD 喂养的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝脏 ATGL 蛋白水平。（m）CD 或 HFD 喂养的 Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠肝脏 ATGL 蛋白水平。（n）Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝脏中 Pnpla2 mRNA 水平。（o）Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠肝脏中 Pnpla2 mRNA 水平。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。（p）肝细胞在指定时间内用环己酰亚胺（CHX）培养后，ATGL 蛋白表达情况。n 代表独立样本数量。
SPHK2通过H335位点竞争性结合ATGL并抑制COP1介导的泛素化
为深入研究 SPHK2 调控 ATGL 蛋白稳定性的具体机制，研究者分离 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝细胞，并分别使用溶酶体抑制剂氯喹（chloroquine）或蛋白酶体抑制剂 MG-132 处理。MG-132 可显著提高 Sphk2-HKO 肝细胞中的 ATGL 蛋白丰度，而氯喹无法恢复 Sphk2 缺乏导致的 ATGL 下调，提示 ATGL 主要经蛋白酶体途径降解。与此一致，在棕榈酸暴露的肝细胞中，Sphk2 缺乏增强了 ATGL 泛素化。
E3 泛素连接酶 COP1 已被证明可与 ATGL 相互作用，导致 ATGL 多聚泛素化和蛋白酶体降解。研究者在 293T 细胞中共同转染 Myc-Atgl 和 Flag-Cop1，确认二者存在相互作用。进一步实验显示，在棕榈酸培养的肝细胞中，Cop1 siRNA 可挽救 Sphk2 缺失造成的 ATGL 下调。Cop1 敲低和 SPHK2 过表达均可降低 Sphk2-HKO 肝细胞中 ATGL 的泛素化和降解；同时，Cop1 敲低还可逆转 Sphk2 缺乏导致的 ATGL 泛素化和降解。此外，Cop1 敲低能够恢复 Sphk2 缺失引起的细胞脂质积累和总 TG 含量升高。这些结果说明，SPHK2 可通过抑制 COP1 诱导的 ATGL 泛素化来减少脂质沉积。
为了从结构层面理解 SPHK2-ATGL 相互作用，研究者对 SPHK2 和 ATGL 进行了分子对接模拟。SPHK2 和 ATGL 模型通过结合 N 端同源建模与 C 端从头建模构建，并经过 AMBER12/EHT 能量最小化和 Ramachandran 图验证。研究者利用 ClusPro 进行定向对接模拟，识别出 SPHK2 与 ATGL 之间两个不同的相互作用界面（IF1 和 IF2）。在 IF1 界面中，ATGL 的缬氨酸（V361）氮原子与 SPHK2 的组氨酸（H335）咪唑基之间形成氢键；IF2 界面则由两种蛋白的 N 端结构域构成。模拟中低骨架波动显示系统达到平衡状态，说明结构系统稳定。
由于 SPHK2 的 H335 可直接结合 ATGL 的 V361，研究者构建了 Myc-Sphk2H335A 突变质粒。该突变显著降低 SPHK2 对 ATGL 的结合能力。SPHK2H335A 过表达无法抵消棕榈酸处理的 Sphk2 缺失肝细胞中 ATGL 的下调。与此一致，SPHK2 过表达可逆转 COP1 过表达介导的 ATGL 降解，而 SPHK2H335A 突变体无法产生这一逆转作用。此外，SPHK2H335A 突变体也无法缓解棕榈酸诱导的脂质积累。总体而言，这些结果表明，SPHK2 通过其 H335 位点与 ATGL 相互作用，从而阻止 E3 泛素连接酶 COP1 与 ATGL 结合，最终抑制 ATGL 的泛素化介导降解。
研究者还进一步探究了 SPHK2 的亚细胞定位是否影响 ATGL 介导的脂质积累。与 MASLD 患者肝脏中细胞质 SPHK2 显著减少的结果类似，棕榈酸诱导后细胞质中 SPHK2 蛋白丰度也下降。这提示细胞质 SPHK2 下调可能参与肝脏脂质积累。为进一步明确 SPHK2 亚细胞定位在 ATGL 介导脂质积累中的具体作用，研究者构建并验证了两种空间定位突变体：核排除型（NLS）突变和胞质排除型（NES）突变。与 SPHK2（NESmut）相比，SPHK2（NLSmut）可显著降低棕榈酸诱导的 ATGL 降解，并减少相应的脂质积累。这些结果提示，细胞质 SPHK2 可通过抑制 ATGL 降解来减轻肝脂肪变性。
图5：SPHK2 通过 H335 位点与 ATGL 相互作用，并抑制 COP1 介导的泛素化。（a）MG-132（10 μM）或氯喹（Chlor，10 μM）处理原代肝细胞后，ATGL 蛋白水平的免疫印迹分析。（b）在 PA 诱导的原代肝细胞中进行泛素化实验，以检测内源性 ATGL 的泛素化介导降解。（c、d）在 293T 细胞中进行 Co-IP 实验，以研究 ATGL 与 COP1 的相互作用。（e）在 Cop1 沉默条件下，棕榈酸培养的 Sphk2 缺失肝细胞中 ATGL 蛋白水平。（f）在 COP1 缺失条件下，PA 处理的 Sphk2 缺失肝细胞中 ATGL 的泛素化实验。（g）Sphk2 缺失肝细胞感染 scramble RNA（SCR）或 siCop1 后，经棕榈酸（PA）处理并进行油红 O 染色及定量分析。比例尺为 20 μm。（h）检测感染 SCR 或 siCOP1 的 Sphk2 缺失肝细胞中甘油三酯（TG）含量。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 5。*P < 0.05。（i）对接形成的 ATGL（青色）与 SPHK2（橙色）复合物。ATGL 与 SPHK2 相互作用的两个界面分别称为 IF1 和 IF2。氢键相互作用用红色表示，盐桥用蓝色表示。（j）ATGL 与 SPHK2 复合物的系统柔性分析。采用均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）评估 ATGL-SPHK2 复合物的柔性。RMSD 用于量化模拟过程中系统生成结构相对于晶体结构随时间发生的偏离。当 RMSD 波动趋于平稳时，说明系统达到稳定状态。（k）Co-IP 实验显示，在转染 Myc-Atgl、His-Sphk2WT 或 His-Sphk2H335A 质粒的肝细胞中，ATGL 与 SPHK2 的相互作用。His-Sphk2H335A 表示 SPHK2 第 335 位组氨酸（H335）发生突变。（l）Sphk2 缺失肝细胞转染空载体、His-Sphk2WT 或 His-Sphk2H335A 后，经 PA 处理时 ATGL 和 SPHK2 蛋白水平的免疫印迹分析。（m）肝细胞转染相应质粒并经 PA 处理后，ATGL 蛋白水平的免疫印迹分析。（n）Sphk2 缺失肝细胞经 PA 处理后，ATGL 的泛素化水平。（o）Sphk2 缺失肝细胞转染空载体、His-Sphk2WT 或 His-Sphk2H335A 后，经 PA 处理并进行油红 O 染色及定量分析。比例尺为 20 μm。（p）Sphk2 缺失肝细胞转染空载体、His-Sphk2WT 或 His-Sphk2H335A 后，经 PA 处理时的 TG 含量。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 5。*P < 0.05。n 代表独立样本数量。
KLF10调控肝脏Sphk2转录
前述结果已经显示，脂肪变性肝脏中 Sphk2 基因表达显著下调，但其背后的分子机制仍不清楚。研究者基于 JASPAR 数据库预测 Sphk2 的潜在转录因子，并将 GSE182365 数据集中 Cluster 2 的差异基因表达数据与 JASPAR 预测的潜在转录因子进行整合，最终识别出 KLF10 可能是 Sphk2 的上游转录抑制因子。
进一步分析 MASLD 和病态肥胖患者肝脏样本数据集 GSE61260 发现，Klf10 与 Sphk2 表达呈负相关。与此一致，HFD 和棕榈酸诱导均可显著提高 KLF10 的 mRNA 水平和蛋白丰度。敲低 Klf10 可显著抑制棕榈酸诱导的 SPHK2 和 ATGL 上调。不过，敲低 Klf10 仅显著增加 Sphk2 mRNA 水平，而 Atgl 基因 Pnpla2 的 mRNA 水平无显著变化。
利用 JASPAR 数据库，研究者在 Sphk2 启动子区域中确定了 3 个潜在 KLF10 结合位点。进一步的荧光素酶报告实验结合一系列 Sphk2 启动子截短构建体显示，-500 到 0 区域对调控 Sphk2 表达至关重要，提示该区域可能包含关键结合位点。此外，敲低 Klf10 可缓解棕榈酸诱导的脂质积累，但在 Sphk2 缺失肝细胞中这一作用消失，提示 KLF10 通过转录调控抑制 Sphk2 基因表达。
图6：Kruppel 样因子 10（KLF10）抑制肝脏中鞘氨醇激酶 2 基因（Sphk2）的转录。（a）Cluster 2 差异基因（黄色）与 JASPAR 预测的 Sphk2 转录因子（蓝色）之间重叠基因的维恩图分析。（b）气泡图显示不同细胞簇中 Klf10 的相对表达。（c）利用 GEO 数据集 GSE61260 分析代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）患者肝组织中 Sphk2 与 Klf10 之间的 Spearman 相关性。（d）高脂饮食（HFD）小鼠肝脏中 Klf10 mRNA 水平。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 6–7。*P < 0.05。（e）棕榈酸（PA）诱导的原代肝细胞中 Klf10 mRNA 水平。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 5。*P < 0.05。（f）HFD 小鼠肝脏中 KLF10 蛋白水平的免疫印迹分析。（g）PA 诱导的原代肝细胞中 KLF10 蛋白水平的免疫印迹分析。（h、i）转染 SCR 或 siKlf10 的 PA 诱导原代肝细胞中 Klf10、Sphk2 以及脂肪甘油三酯脂肪酶/含 patatin 样磷脂酶结构域蛋白 2、三酰甘油脂肪酶（Pnpla2）的相对蛋白水平（h）和 mRNA 水平（i）。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 5。*P < 0.05。（j、k）基于 JASPAR 预测的 Sphk2 启动子中 KLF10 结合位点。（l）将一系列截短的 Sphk2 启动子构建体转染入肝细胞，并进行 PA 处理。随后检测相对荧光素酶活性。当 n < 5 时，未进行统计学分析，结果应视为初步结果。（m、n）转染 SCR、siKlf10 或 siSphk2 的 PA 诱导 AML12 细胞中油红 O 染色和甘油三酯（TG）含量。比例尺为 20 μm。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 5。*P < 0.05。n 代表独立样本数量。
SPHK2G212E在脂肪变性肝脏中的潜在干预价值
为了确定 SPHK2 减轻肝脂肪变性是否不依赖其酶活性，研究者使用表达 SPHK2 突变体的腺相关病毒 AAV8-Sphk2G212E 处理小鼠，并以 AAV8-GFP 作为对照病毒。结果显示，AAV8-Sphk2G212E 可在肝脏中成功过表达 SPHK2。随后，注射 AAV8-Sphk2G212E 或 AAV8-GFP 的小鼠接受 CD 或 HFD 喂养 20 周。
结果显示，AAV8-Sphk2G212E 处理可显著降低小鼠肝脏重量比，并改善胰岛素抵抗。此外，接受 AAV8-Sphk2G212E 处理的小鼠肝脏和血清 TG 水平更低，肝脏脂滴更少，血清 ALT 和 AST 水平也降低。总体而言，这些发现提示，SPHK2 可作为一种肝脏保护蛋白，在不依赖其催化活性的情况下减轻肝脂肪变性。
图7：AAV8-Sphk2G212E 减轻高脂饮食（HFD）诱导小鼠的肝脂肪变性和脂质沉积。（a）注射 AAV8-Sphk2G212E 和 AAV8-GFP 的小鼠肝脏中鞘氨醇激酶 2（SPHK2）蛋白水平的免疫印迹分析。（b）实验设计示意图。注射 AAV8-Sphk2G212E 或 AAV8-GFP 的 C57BL/6J 小鼠接受 HFD 喂养 20 周。（c）感染 AAV8-Sphk2G212E 和 AAV8-GFP 小鼠的肝脏与体重比。（d、e）在感染 AAV8-Sphk2G212E 和 AAV8-GFP 的小鼠中进行腹腔葡萄糖耐量试验（IGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）。（f）感染 AAV8-Sphk2G212E 和 AAV8-GFP 小鼠的肝脏及血清甘油三酯（TG）水平。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。（g）HFD 喂养的 AAV8-Sphk2G212E 和 AAV8-GFP 感染小鼠肝脏切片 H&E 染色。比例尺为 50 μm。（h）HFD 喂养的 AAV8-Sphk2G212E 和 AAV8-GFP 感染小鼠中油红 O 染色及定量分析。比例尺为 50 μm。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 6–7。*P < 0.05。（i）AAV8-Sphk2G212E 和 AAV8-GFP 感染小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和 AST 活性。数据以均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。n 代表独立样本数量。
【Citation】:Yuan B, Ding X, Deng X, Wu T, Xu N, Wang Y, Yang Y, Wang W, Ren X, Cheng W, Li R, Zhao H, Guo J, Li J, Dong W, Zhang Y, Lan T. Noncanonical function of sphingosine kinase 2 (SPHK2) sustains hepatic triglyceride homeostasis.British Journal of Pharmacology.2026;1–21.
【贡献】★★★★★
本研究阐明了一种新的机制：SPHK2 可在不依赖其酶活性的情况下，通过抑制 ATGL 泛素化，促进 TG 水解并减轻肝脂肪变性。SPHK2 可能成为代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）治疗的潜在靶点。
此外，本研究也为筛选面向 MASLD 治疗的新型 SPHK2 抑制剂提供了另一种思路，即相关药物筛选不仅可关注 SPHK2 的酶活性，也可关注其表观遗传调控效应。关于 SPHK2 在肝脂肪变性中的非酶学调控作用，本研究拓宽了 SPHK2 抑制剂的筛选范围，并可能提高相关候选物开发的成功率。
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