抗溶胀可生物降解水凝胶重塑电微环境，驱动脑损伤后内源性神经再生
创伤性脑损伤（TBI）后产生的实质性脑组织缺损，是神经修复领域面临的重大挑战。暴力外部机械冲击直接破坏脑组织并损害神经功能，常导致局灶性组织缺失和坏死空洞形成。然而，成人大脑有限的再生能力和不充分的内源性修复机制严重限制了治疗效果。更关键的是，TBI部位恶劣的损伤微环境导致内源性神经干细胞招募不足和胶质细胞异常激活。尽管外源性神经干细胞移植被认为是一种有前景的策略，但细胞来源有限、存活率低、分化效率不佳以及免疫排斥等问题阻碍了其临床转化，且该方法无法为功能性神经回路重建提供结构支撑。因此，开发一种兼具抗溶胀性能和微环境重塑能力的活性生物材料基质，成为了该领域的研究前沿。
针对上述挑战，天津大学崔春燕副研究员、刘文广教授、清华大学李舟教授团队，设计了一种通过两种美国食品药品监督管理局批准的药物——硫辛酸和二甲双胍——经多氢键作用超分子自组装而成的抗溶胀、可生物降解的粘附性水凝胶。该水凝胶基质能够模拟天然脑组织的力学和电学特性。在降解过程中，释放的硫辛酸可将损伤部位重塑为促再生微环境，而二甲双胍则能促进内源性神经干细胞自发募集至缺损区域。当与柔性皮层电极和外源性电刺激整合时，该系统能进一步引导神经干细胞定向分化为功能性神经元。在大量脑缺损大鼠模型中，该策略实现了14.8倍的神经干细胞招募增加和11.3倍的神经元分化增强，并使组织缺损体积减少78%，同时实现了显著的功能恢复。相关论文以“An antiswelling biodegradable hydrogel reshapes electro-microenvironment to drive endogenous neuroregeneration after brain defect”为题，发表在Science Advances上。
图1. LMSA水凝胶的设计及其与电刺激策略结合的示意图。 展示了LMSA水凝胶的构建及其与ECoG电极整合用于TBI后电刺激和信号监测的示意图。该系统协同招募并诱导内源性神经干细胞向神经元分化，同时抑制神经炎症并促进血管生成，从而实现多功能脑修复。
研究团队首先对水凝胶的制备和特性进行了系统表征。他们发现，通过精确调控硫辛酸与二甲双胍的比例，可将硫辛酸的去质子化程度控制在95.72%至97.2%之间，此时系统能够自发自组装形成水凝胶（图2，A和B）。傅里叶变换红外光谱证实了强离子氢键和盐桥氢键的形成（图2C）。等温滴定量热法分析表明，硫辛酸与二甲双胍之间的相互作用是焓驱动的自发过程，解离常数为3.23×10⁻⁶ M，证实了特异性氢键结合的存在（图2D）。拉曼光谱中二硫键特征峰的分裂表明硫辛酸二硫五元环发生了开环聚合（图2E）。X射线衍射图谱显示，与纯硫辛酸和二甲双胍的尖锐结晶峰不同，该水凝胶呈现出宽泛的无定形图案，进一步确认了开环聚合的发生（图2F）。
图2. LMSA水凝胶的表征。 (A) 显示不同组成比例的LA和Met溶液凝胶化能力的数码照片。(B) 不同浓度LA和Met的相图。(C) 不同组成的LA、Met和LMSA水凝胶的FTIR光谱。(D) Met滴定LA的ITC原始数据、拟合曲线及热力学参数。(E) 不同组成的LA、Met和LMSA水凝胶的拉曼光谱。(F) 不同组成的LA、Met和LMSA水凝胶的XRD图谱。
在力学性能方面，时间扫描结果显示储能模量始终大于损耗模量，证实了水凝胶的稳固凝胶状态（图3A）。角频率扫描测试表明，在接近人体固有节律的100 rad/s频率下，水凝胶的储能模量落在天然脑组织0.2至3.1 kPa的范围内，这种组织匹配的模量对于最大程度减少对周围环境的机械损伤至关重要（图3B）。剪切速率-粘度曲线显示了典型的剪切变稀行为，使其能够轻松通过注射器挤出并填充不规则形状的缺损（图3C）。在组织粘附性能评估中，该水凝胶对包括脑组织在内的多种湿软组织表现出强粘附性，在180度倾斜的表面上新鲜大鼠脑组织仍能稳定粘附而不脱落（图3，D和E）。定量测试显示，探针 tack测试的脱附力随硫辛酸/二甲双胍含量增加而显著增加（图3，F和G）。搭接剪切测试显示，LMSA-0.3在新鲜猪皮肤上表现出最高的粘附强度，为16.21±0.55 kPa（图3，H和I）。180°剥离测试中，LMSA-0.3的界面韧性最强，达到133.42±13.53 J/m²（图3，J和K）。对猪坐骨神经的拉伸测试显示，粘附力最高可达15.90 cN，这对于缓解神经修复过程中的神经外膜弹性回缩至关重要（图3，L和M）。
图3. LMSA水凝胶的力学和粘附性能。 (A) 不同组成LMSA水凝胶的时间扫描。(B) 不同组成LMSA水凝胶的角频率扫描。(C) 不同组成LMSA水凝胶的剪切速率-粘度曲线。(D) LMSA-0.25对各种湿组织的粘附能力。(E) 使用倾斜平面法评估LMSA水凝胶粘附效果。(F和G) 不同组成LMSA水凝胶的探针 tack测试曲线和最大粘附力。(H和I) 不同组成LMSA水凝胶在新鲜猪皮肤上的搭接剪切测试曲线和粘附强度。(J和K) 不同组成LMSA水凝胶在新鲜猪皮肤上的180°剥离测试曲线和界面韧性。(L和M) 不同组成LMSA水凝胶在新鲜猪坐骨神经上的拉伸测试曲线和拉伸力。
在导电性能方面，该水凝胶通过羧基的氢离子作为主要电荷载流子实现离子导电（图4A）。导电率范围为0.3至0.7 S/m，与生理神经组织相匹配（图4B）。与先前报道的用于TBI治疗的水凝胶相比，LMSA-0.25展现出与神经组织相匹配的力学强度和电导率，以及辅助粘附效应（图4C）。将水凝胶与柔性电极整合后，电极在低频至生理相关频率范围内阻抗显著低于金电极（图4，D和E）。循环伏安扫描显示水凝胶整合电极的电荷存储容量大于金电极（图4，F和G）。在1000次循环伏安扫描后，水凝胶整合电极的阻抗变化可忽略不计，表现出优异的循环稳定性（图4H）。在±0.1 V、1 ms的固定电压脉冲刺激下，水凝胶整合电极实现了比金电极更高的电流密度（图4I），并在长期循环测试中保持稳定的电荷注入性能（图4J）。
图4. LMSA水凝胶的导电性能。 (A) LMSA水凝胶离子传导机制示意图。(B) 不同组成LMSA水凝胶的电导率。(C) 将LMSA水凝胶的模量、电导率和粘附强度与先前报道的用于TBI治疗的水凝胶进行比较。(D) Au电极和水凝胶电极在全频率范围内的阻抗谱。(E) 1 kHz下的阻抗幅值比较。(F) -0.5至0.1 V的CV扫描。(G) CSC定量。(H) 1000次CV循环后的循环后阻抗谱。(I) +0.1 V脉冲刺激下的电荷密度瞬态。(J) 循环测试期间的电荷注入容量保持率。
在细胞相容性评估中，活-死染色和CCK-8检测显示，即使在1 mg/ml浓度下，LMSA-0.25水凝胶对PC12细胞和神经干细胞均无显著细胞毒性（图5，A至C）。示意图展示了电刺激与水凝胶联合干预显著促进神经元分化的机制（图5D）。划痕实验结果显示，在8小时时间点，水凝胶联合电刺激组的细胞迁移面积达到46.66±4.53%，显著高于对照组的22.45±5.17%（图5，E和F）。免疫荧光染色显示，电刺激显著增强了神经干细胞向神经元的分化，分化率达到约60%，而水凝胶联合电刺激则将分化率进一步提升至近80%（图5，G和H）。
图5. LMSA水凝胶+电刺激的细胞相容性及对神经干细胞分化的促进活性。 (A) 活-死染色表征LMSA-0.25水凝胶对PC12细胞的细胞相容性。(B) 检测PC12细胞与LMSA-0.25水凝胶共培养细胞活力的CCK-8检测。(C) 检测神经干细胞与LMSA-0.25水凝胶共培养细胞活力的CCK-8检测。(D) 示意图显示电刺激与水凝胶联合干预显著促进神经元分化。(E) 8小时神经干细胞划痕实验结果。(F) 划痕实验中伤口愈合百分比的定量分析。(G) 神经干细胞的Nestin和Tuj-1免疫荧光图像。Nestin标记为红色，Tuj-1标记为绿色。细胞核用蓝色DAPI标记。(H) 基于免疫荧光染色结果的Tuj-1阳性表达比例。(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001)
Transwell迁移实验表明，水凝胶降解产物能显著促进神经干细胞的趋化迁移。在体内实验中，研究团队采用控制性皮层撞击法建立了大鼠大量脑缺损模型（图6，A和B）。电刺激通过植入的柔性电极每天连续五天、每次20分钟的方式递送（图6，C和D），示波器记录的代表性双相电流刺激波形如图6E所示。免疫荧光染色结果显示，在伤后第7天，水凝胶联合电刺激组的巢蛋白阳性面积达到25.2±2.25%，较未治疗TBI组的1.7±0.08%实现了14.8倍的增加，证实了该策略对内源性神经干细胞的有效招募（图6，F和H）。在伤后第14天，联合治疗组的Tuj-1阳性表达增加了11.3倍（图6，G和I）。京都基因与基因组百科全书通路富集分析表明，差异表达基因主要富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用、神经活性配体-受体相互作用、趋化因子信号通路和丝裂原活化蛋白激酶信号通路中（图6J）。磷酸化ERK1/2的表达在联合治疗组中显著升高（图6，K和M），基因集富集分析进一步证实了相关通路的富集（图6L）。
图6. LMSA水凝胶+电刺激促进损伤部位内源性神经干细胞的招募和分化。 (A) 照片显示建立大鼠TBI模型以及水凝胶注射和电极植入的手术过程示意图。(B) 植入电极的数码照片。(C) 大鼠在记录电信号过程中的实验图像。(D) 一次典型的电刺激疗程持续20分钟。(E) 示波器记录的电刺激波形。(F) 伤后7天损伤区域Nestin（绿色）的典型免疫荧光染色图片，用于研究内源性NSC的招募。(G) 伤后14天病变区域Tuj-1（绿色）的典型免疫荧光染色图片，用于评估NSC向神经元的分化。(H) 每个视野Nestin阳性面积的定量。(I) 每个视野Tuj-1阳性面积的定量。(J) TBI组与TBI+水凝胶+电刺激组之间差异表达基因的KEGG通路富集气泡图。(K) 伤后7天病变区域p-ERK1/2（红色）的典型免疫荧光染色图片。(L) TBI组和TBI+水凝胶+电刺激组的GSEA结果。(M) 每个视野p-ERK1/2阳性面积的定量。黄色方框表示放大区域。
在组织修复评估中，双重免疫荧光染色显示联合治疗组在伤后第7天显著抑制了Iba-1阳性小胶质细胞和GFAP阳性星形胶质细胞的过度激活（图7，A、C和D）。双重免疫荧光染色显示联合治疗组在伤后第28天呈现出最丰富的神经丝和髓鞘碱性蛋白阳性结构（图7，B、H和I）。大体标本照片显示，联合治疗组的组织缺损最小（图7E）。尼氏染色进一步证实联合治疗组在伤后第28天显示出更高的神经元密度和活性（图7F）。Masson三色染色显示，联合治疗组的胶原面积比例降至29.65±2.20%，较TBI组的58.50±3.23%减少了近两倍（图7G）。组织缺损率的定量分析显示，联合治疗组较未治疗TBI组减少了78.24%（图7J）。雷达图将LMSA水凝胶联合电刺激的性能和修复效果与最近报道的TBI治疗方法进行了全面比较（图7K）。
图7. LMSA水凝胶+电刺激重塑微环境并促进脑组织结构重塑。 (A) 伤后7天病变部位Iba-1（红色）和GFAP（绿色）的代表性双重免疫荧光染色图片，用于研究神经炎症的抑制。(B) 伤后28天病变部位NF（红色）和MBP（绿色）的代表性双重免疫荧光染色图片，用于评估轴突再生和髓鞘再生。(C和D) 每个视野Iba-1和GFAP阳性面积的定量。(E) 伤后28天大鼠脑组织的数码照片。红色虚线表示组织缺失的边界。(F) 伤后28天所有组别的代表性尼氏染色图像。红色虚线表示组织缺失的边界。(G) 每个视野胶原面积的定量。(H和I) 每个视野NF和MBP阳性面积的定量。(J) 伤后28天组织缺损率的定量。(K) 将LMSA水凝胶+电刺激的性能和修复效果与最近报道的TBI治疗方法进行比较的雷达图。黄色方框表示放大区域。
在电生理信号记录方面，皮层电图分析显示，伤后第1天，电刺激组和联合治疗组均表现出交替的癫痫样放电和扩散性去极化事件（图8，A和B）。时间-频率分析显示，联合治疗组在所有评估时间点的δ+θ/α+β功率比值均持续低于电刺激组，表明该联合疗法有效保护了丘脑皮质功能并减轻了继发性损伤的进展（图8C）。
在神经功能恢复评估中，改良神经功能缺损评分显示联合治疗组在所有时间点的评分降低最为显著（图8D）。转棒实验证实联合治疗组在棒上停留时间显著延长（图8，E和H）。蔗糖偏好实验显示联合治疗组的蔗糖偏好指数改善最为明显，表明其在缓解抑郁样行为方面的优势（图8，F和I）。莫里斯水迷宫实验显示，在21至27天的训练期间，联合治疗组的逃避潜伏期最短（图8，J和K），在空间探索实验中联合治疗组在目标象限停留时间最长且穿越原平台位置的次数最多（图8，L和M），表现出显著更优的空间学习记忆能力。
图8. TBI后ECoG分析和神经功能恢复。 (A) 所示TBI后时间点的代表性3分钟ECoG轨迹。ED和SD分别用蓝色和红色突出显示。通过小波变换分析得出的ECoG信号的时频表示。(B) ECoG信号的时频表示。(C) δ+θ/α+β功率比值的时间演变。(D) mNSS评分用于检查大鼠的神经运动功能恢复。(E和H) 用于评估大鼠运动协调和平衡能力的转棒实验。(F和I) 用于评估大鼠情绪行为的蔗糖偏好实验。(G和J至M) 学习和空间记忆阶段大鼠的代表性游泳路径(J)、逃避潜伏期(K)、目标区域时间比(L)以及通过Morris水迷宫测量的平台穿越次数(M)。
总结而言，该研究开发了一种基于临床批准的硫辛酸和二甲双胍的可注射、导电、粘附性水凝胶，与柔性皮层电极整合后用于创伤性脑损伤治疗。该水凝胶实现了从被动结构支撑到主动适应性神经微环境重编程的范式转变。二甲双胍促进内源性神经干细胞招募，硫辛酸重塑不利微环境以支持神经元分化，而外源性电刺激则进一步增强了神经发生和功能修复。该整合平台还能实时传输和记录局部电生理信号，为创伤性脑损伤修复过程中的实时监测和功能恢复评估提供了可能。该策略克服了外源性神经干细胞移植的关键局限性，为创伤性脑损伤的临床干预提供了坚实的理论基础和技术支持，并为开发反馈控制的神经调控系统奠定了重要基础。未来研究将聚焦于建立皮层电图信号特征与神经功能状态之间的关联模型，开发简化的反馈控制算法，实现对电刺激参数的动态调整，推动反馈控制神经调控方案的系统化和实际应用。
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