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Introduction
多酚是自然界中分布最广泛的植物化学物质，在食品和饮料中含量丰富，对人体健康具有重要意义。多项临床研究报道了富含多酚的饮食具有抗炎、血脂代谢功能调节和胃肠道保护作用。多酚的降解代谢产物，如尿石素和酚酸也对炎症和肠屏障功能损伤具有有益的调节效果。绿原酸（CGA），又称5-O-咖啡酰奎宁酸，是日常饮食中含量最丰富的酚酸之一。咖啡豆、马铃薯块茎、金银花、洋蓟等食物中富含CGA。多项研究报道了CGA具有抗炎、降压、抗糖尿病和抗肿瘤的活性。特别是随着咖啡消费量的增加，研究其活性成分CGA的吸收代谢及其体内物质基础，将促进对其健康效应的认识和相关功能性食品的开发。
CGA在肠道中能够调节消化功能、肠道炎症和菌群。研究发现，CGA可以刺激肠道细胞分泌GLP-1，一种能够调节能量稳态的肠道激素。CGA能够调节肥胖大鼠肠道钠/葡萄糖协同转运蛋白1（SGLT-1）和葡萄糖转运蛋白2（GLUT-2）的表达。作者之前的研究发现CGA可抑制核因子κB（NF-κB）/核苷酸结合域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体通路，这可能是CGA预防结肠炎的部分机制。CGA可以改变菌群结构，改善机体的肠道菌群失调。然而，CGA可能在胃肠道中发生广泛的生物转化，产生多种代谢物，不同代谢物可能具有不同的生物活性，从而对CGA的健康效应产生影响。
CGA本身的生物利用度有限，主要受限于其在机体内复杂的代谢途径。口服摄入CGA后，其酯键会被水解断裂，在肝脏和肠道中首先通过II相代谢产生葡萄糖醛酸、硫酸化和甲基化代谢产物。这一过程由UDP-葡糖醛酸基转移酶（GT）、硫酰基-O-转移酶（ST）和儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）的作用介导。特别是未被吸收的CGA可能被结肠微生物代谢。肠道代谢产物又会被重吸收，通过肠肝循环再次进入肠腔。微生物的酰基奎尼酸酯酶已被证实可以将CGA降解为咖啡酸和奎尼酸，而咖啡酸和奎尼酸通过双键还原和在芳香环的C3-或C4位去羟化形成苯丙酸和苯甲酸的羟化衍生物。虽然已有多项体外和原位研究探讨了咖啡在肠道中的代谢途径，其中涉及CGA与食物基质中其他成分的相互作用，而单体CGA在肠道不同部位的主要代谢产物仍不清楚。生理可及浓度的CGA代谢物在肠道中的活性功能尚不明确。详细的代谢数据和代谢产物的生物活性研究对于阐明CGA对肠道的益处以及进一步解释CGA在体内发挥生物学效应的物质基础具有重要意义。
综上，本工作研究了CGA及其代谢物在胃肠道不同部位的分布。此外，还进行了CGA的菌群代谢研究，以明确代谢物在不同组织中分布存在差异的主要驱动因素。在细胞实验中，评估了CGA菌群代谢物对肠道炎症和肠道屏障功能的调节作用，这将有助于更好地理解肠道微生物在膳食CGA健康效应中的作用。
Results
CGA肠道代谢产物的鉴定
采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS）技术分析50 mg/kg bw （262 μmol/kg bw）的CGA灌胃小鼠后不同时间点胃肠道组织中代谢物的分布。根据质谱采集数据，共发现13 种具有高响应的代谢物，分别为protocatechuic acid（M1）、catechol（M2）、4-hydroxybenzoic acid（M3）、dihydrocaffeic acid-3-O-sulfate（M4）、chlorogenic acid-3-O-sulfate（M5）、5-O-feruloylquinic acid-O-sulfate（M6）、caffeic acid-3-O-sulfate（M7）、ferulic acid-4-O-sulfate（M8）、caffeic acid（M9）、5-O-feruloylquinic acid（M10）、homovanillic acid（M11）、3-hydroxyphenylpropionic acid（M12）和ferulic acid（M13）。代表性样品的特征离子色谱图和CGA及其代谢物MS/MS片段图如图1和图2所示。
图1 CGA肠道代谢产物的UPLC-MS图谱
图2 CGA肠道代谢产物的UPLC-MS碎片模式
CGA在肠道和粪便中的分布
图3显示了CGA及其主要代谢物的含量-时间曲线，并且大部分曲线呈双峰或三峰。胃和小肠在0.5~2.0 h出现第一个峰值，大肠在4~8 h出现第一个峰值，近端小肠在2~4 h出现第2 个峰值，远端小肠和大肠在6~8 h出现第2 个峰值。此外，CGA代谢物类型在不同肠道组织中的分布存在明显差异。小肠内大量检测到M13及其硫酸结合物M8和M4。M12首先出现在回肠，然后大量存在于大肠中。M1和M2仅在大肠中存在，M9在小/大肠中普遍存在。最后，在大肠中未检测到CGA，表明其被充分代谢。
4 h大肠中的CGA及其代谢产物总量为（861±312.9 nmol），是小肠（409±99.1 nmol）的2 倍。此外，M12在胃肠道中的分布水平最高，Cmax为（298±101.4） nmol，占大肠总代谢物含量的34.6%（图3）。
CGA及其代谢物的肠道总量-时间曲线如图4A所示。结果显示结肠>盲肠>回肠>胃>空肠>十二指肠的AUC0-t值（nmol·h）。M1、M9、M2和M12是CGA给药后小鼠粪便中的主要代谢物（图4B）。M12的AUC0-t（nmol·h）大于其余CGA代谢物的总和。粪便中未检测到CGA。粪便中CGA代谢物的排泄最早在8 h达到峰值，稍晚于结肠中。8 h时粪便中CGA代谢物总量为167 nmol，占给药剂量的3.2%。
图3 CGA及其代谢产物在肠道的分布
图4 肠道总代谢物分布及粪便中CGA及其代谢物分布
CGA的体外微生物代谢
CGA及其代谢物总量分别在8 h和16 h达到峰值，相对含量分别为83.9%和89.2%。M1或M2的最终浓度比M12低3.5 倍，M9被耗尽。粪便孵育产生的微生物代谢物与结肠和粪便中的代谢产物种类一致，但与小肠中的代谢产物有较大差异。通过人粪便体外发酵进一步验证了动物实验结果。如图5B所示，M12是人体微生物代谢产生的CGA的主要代谢产物，占总代谢产物的50%以上。发酵24 h后，主要的微生物终产物为M1、M2和M12，也检测到微量M3。
图5 CGA的体外微生物代谢
CGA体外发酵过程中肠道菌群的变化
指示菌群α-多样性的Shannon指数在人粪便发酵CGA过程中显著增加（图6A）。OTU水平的PCoA分析显示了不同的聚类模式，12 h和24 h粪便培养的微生物群落显示出相似的聚类（图6B）。门或科水平的微生物相对丰度见图6C-D。如图6E所示，粪便发酵24 h后，Escherichia-Shigella、Mitsuokella和Clostridium_sensu_stricto_1的相对丰度显著降低。CGA显著提高了Megasphaera、Dorea和Flavonifractor的相对丰度。
图6 体外人类粪便发酵过程中的肠道微生物分析
Caco-2/HT-29 MTX共培养细胞模型中CGA及其代谢产物对LPS诱导炎症反应的影响
与LPS组相比，原儿茶酸（PA）和儿茶酚（CAT）处理导致IL-6和TNF-α的mRNA表达水平显著降低，咖啡酸（CA）和3-羟基苯丙酸（3HPPA）干预可显著降低TNF-α的相对表达量。进一步对细胞培养基中促炎细胞因子水平进行ELISA定量（图7D-E），发现CGA和代谢产物咖啡酸，3-羟基苯丙酸和原儿茶酸有效抑制了LPS诱导的TNF-α含量增加。这些结果表明，CGA的微生物代谢产物有效地降低了促炎细胞因子的表达和分泌，最终减轻了LPS诱导的细胞炎症。
图7 CGA及其代谢产物对细胞炎症的影响
CGA及其代谢产物对肠屏障功能损伤的影响
图8A-B所示，CGA及其代谢物儿茶酚可显著上调Muc2 mRNA的表达。与LPS组相比，咖啡酸、3-羟基苯丙酸和儿茶酚均显著增加occludin mRNA的表达。为了进一步研究CGA代谢产物对细胞间紧密连接的影响，进行了occludin免疫荧光染色。对图8C-D免疫荧光染色的结果分析表明，与LPS组相比，CGA组和代谢物组的荧光强度显著增加，提示CGA及其代谢物显著上调occludin蛋白的表达。
图8 CGA及其菌群代谢物对肠道屏障功能的影响
Conclusion
本研究发现，口服CGA后，胃肠道中有大量的CGA及其代谢物的产生和存在。其中，硫酸化代谢物在小肠中广泛分布，而3-羟基苯丙酸、原儿茶酚酸和儿茶酚可能由肠道微生物产生，在大肠中含量丰富。CGA微生物代谢产物能够显著降低细胞炎症水平并改善肠屏障紧密连接蛋白损失。综上，本研究深入探讨了CGA在胃肠道中的代谢、微生物对CGA代谢的影响，并对CGA代谢产物的肠道保护特性进行了初步评估。
作者简介
张云辉，男，博二在读，就读于南开大学医学院，生物化学与分子生物学专业，研究方向为膳食多酚与肠道健康，目前已发表SCI论文5 篇。
张博崴，男，南开大学医学院，副教授，硕士生导师，Frontiers in Nutrition、Nutrients等杂志客座编辑，天津市整合医学学会常务委员，研究方向为膳食营养与肠道菌群的相互作用、营养素代谢的个体差异与精准营养和膳食活性成分与慢病干预。近五年在Advanced Materials, Trends in Food Science & Technology，Current Opinion in Food Science等期刊发表SCI收录论文50余篇，主持/参与国家和地方项目10余项，授权国家发明专利9 项。
王硕，男，南开大学医学院特聘教授，教育部长江学者特聘教授，国家杰出青年基金获得者，首批入选国家“万人计划”领军人才，人事部“百千万人才工程”国家级人选，教育部“新世纪优秀人才”计划，科技部“创新人才推进计划”中青年科技创新领军人才，享受国务院特殊津贴，主要研究领域包括小分子免疫检测理论和检测新技术的研究与开发；“仿生抗体”合成与反应机理及替代生物抗体免疫检测理论和检测技术；食品加工过程质量安全控制技术的研究和开发；食品安全风险评估；食品营养与免疫研究。主持多项国家自然科学基金及重点研发计划项目，以第一或通信作者身份发表学术论文400余篇。
Gastrointestinal distribution and in vitro-microbial biotransformation of chlorogenic acid
Yunhui Zhanga,1, Bowei Zhanga,1, Xiaoxia Liua, Xiang Lia, Fan Weia, Lingda Zhaoa, Huan Lva, Xudong Wangb, Jin Wanga, Jing Wua, Yan Zhanga, Shuo Wanga,*
a Tianjin Key Laboratory of Food Science and Health, School of Medicine, Nankai University, Tianjin 300071, China
b College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China
*Corresponding author.
Abstract
Chlorogenic acid (CGA), as a polyphenol abundant in daily diet, exerted various intestinal functions. However, the material basis of its intestinal bioactivities was still unclear. Our study investigated the gastrointestinal distribution of CGA using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrum (UPLC-MS/MS) and explored the main drivers leading to different metabolic fates of the metabolites. After oral administration of 50 mg/kg bw CGA to mice, CGA and sulfated metabolites were mainly determined in small intestine. Protocatechuic acid, catechol, and 3-hydroxyphenylpropionic acid were found in copious amounts in large intestine and feces. Besides, caffeic acid existed in the entire intestine and feces. In the in vitro mice/human fecal fermentation of CGA, the production of metabolites was consistent with that in the colon, indicating that microorganisms might lead to the difference in the gastrointestinal distribution of CGA metabolites. Moreover, CGA, 3-hydroxyphenylpropionic acid, protocatechuic acid, catechol, and caffeic acid reduced proinflammatory cytokines (interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α)) and increased mucin (Muc2) and tight junction (occludin) mRNA in LPS-induced Caco-2/HT-29 MTX co-culture cells. In conclusion, the biotransformation of CGA in different gastrointestinal tracts varied significantly, and its metabolites could partially support its intestinal bioactivities.
Reference:
ZHANG Y H, ZHANG B W, LIU X X, et al. Gastrointestinal distribution and in vitro-microbial biotransformation of chlorogenic acid[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(7): 9250312. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250312.
本文编译内容由作者提供
编辑：王佳红；责任编辑：孙勇
封面图片：图虫创意
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