2026年6月14日，重庆医科大学附属第二医院感染病科、感染性疾病分子生物学教育部重点实验室、病毒性肝炎研究所彭明利、胡鹏、凌宁团队，联合达州市中心医院内分泌与代谢科，在Phytomedicine（中科院1区，TOP期刊，IF=11.3） 发表题为 “Natural small molecule evodiamine alleviates liver fibrosis by targeting the ANXA2-p110α axis in hepatic stellate cells” 的研究论文。Yong Sun 和 Zongyi Liu 为共同第一作者，Ning Ling、Peng Hu 和 Mingli Peng 为共同通讯作者。该文于2026年4月1日投稿，2026年5月27日修回，2026年6月14日接收。
肝纤维化是多种慢性肝病进展为肝硬化和肝细胞癌的重要病理阶段。目前临床治疗仍以病因控制为主，能够直接干预纤维化进程的药物仍然有限。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化和增殖是细胞外基质沉积及肝纤维化进展的核心事件，因此，寻找能够抑制 HSC 活化的天然小分子，是抗肝纤维化药物开发的重要方向。
在本研究中，作者从安络化纤丸、扶正化瘀胶囊和鳖甲软肝片等临床常用抗纤维化中药复方出发，结合网络药理学、TGF-β1 诱导的 HSC 活化模型以及体内多模型验证，系统筛选具有抗纤维化潜力的天然小分子。结果显示，在23个优先候选化合物中，吴茱萸碱（evodiamine，EVO）对 HSC 活化和增殖表现出最明显的抑制作用。
进一步研究发现，EVO 可显著降低人源 LX-2 细胞和大鼠 HSC-T6 细胞中 COL1A1、ACTA2（α-SMA）、Collagen I 等纤维化相关指标的表达，并抑制 HSC 增殖。体内实验中，作者分别构建了 CCl₄ 诱导肝纤维化模型、DDC 诱导胆汁淤积性纤维化模型，以及高脂饮食联合 CCl₄ 诱导的 MASH 相关纤维化模型。EVO 在多个模型中均能改善肝功能指标，减轻胶原沉积、肝组织损伤和纤维化病理改变，并且在测试剂量范围内未观察到明显系统毒性。
机制方面，研究通过药物亲和响应靶点稳定性分析（DARTS）、生物层干涉技术（BLI）、细胞热转变分析（CETSA）以及分子对接等方法，鉴定膜联蛋白A2（Annexin A2，ANXA2）为 EVO 的直接结合靶点。ANXA2 在活化的 HSC 中富集，并在小鼠纤维化肝组织和人类纤维化肝组织标本中明显上调，其表达与肝纤维化严重程度呈正相关。
作者进一步证明，EVO 可通过涉及 Ser22 和 Val27 的位点结合 ANXA2，并促进 NEDD4L 介导的 K48 连接泛素化，从而加速 ANXA2 的蛋白酶体降解。同时，EVO 还可破坏 ANXA2 与 PI3K 催化亚基 p110α 之间的相互作用，抑制 PI3K-AKT 信号通路，最终降低 HSC 的活化和增殖。ANXA2 过表达会部分削弱 EVO 的抗纤维化作用，而 ANXA2 抑制或敲低则可模拟 EVO 的部分效应，进一步支持 ANXA2 是 EVO 发挥抗纤维化作用的重要分子靶点。
总体而言，该研究从临床常用抗纤维化中药复方中筛选出天然小分子 EVO，并揭示了其通过靶向 ANXA2-p110α 轴 缓解肝纤维化的新机制。该发现不仅为理解 EVO 的抗纤维化作用提供了新的分子依据，也为围绕 ANXA2 进行抗肝纤维化药物开发提供了潜在方向。需要强调的是，目前研究证据主要来自细胞实验和小鼠模型，EVO 的临床转化价值仍需进一步的药代动力学、安全性和长期疗效研究加以验证。
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【摘要】
背景：肝纤维化是慢性肝损伤的常见后果，但目前能够直接阻断纤维化发生发展的药物干预手段仍然有限。
目的：本研究旨在从临床有效的抗纤维化中药复方中筛选能够抑制肝星状细胞（HSC）活化的天然化合物，并进一步阐明其潜在作用机制。
研究设计与方法：研究采用网络药理学，并结合转化生长因子 β1（TGF-β1）诱导的肝星状细胞活化模型，筛选天然小分子化合物；随后在 CCl₄、DDC 以及高脂饮食联合 CCl₄（HFD+CCl₄）诱导的小鼠肝纤维化模型中进行体内验证。研究还通过药物亲和响应靶点稳定性分析（DARTS）、生物层干涉技术（BLI）和 RNA 测序（RNA-seq）开展直接靶点鉴定和机制分析。
结果：在 23 个优先筛选出的候选化合物中，吴茱萸碱（EVO）显著抑制了人 LX-2 细胞和大鼠 HSC-T6 细胞中肝星状细胞的活化与增殖。在 3 种小鼠模型中，EVO（50 mg/kg）明显改善肝功能和纤维化病理改变，且未引起明显毒性。膜联蛋白 A2（ANXA2）被鉴定为 EVO 的直接结合靶点；ANXA2 在活化的肝星状细胞中富集，并在纤维化小鼠肝脏和人类纤维化肝组织标本中上调。机制上，EVO 通过涉及 Ser22 和 Val27 的位点与 ANXA2 结合，并促进 NEDD4L 介导的 K48 连接泛素化及 ANXA2 降解。此外，EVO 还破坏 ANXA2 与 PI3K 催化亚基 p110α 之间的相互作用，从而抑制肝星状细胞中的 PI3K-AKT 信号通路。
结论：本研究鉴定出 EVO 是一种具有抗肝纤维化活性的天然化合物，并揭示了一种此前尚未认识到的机制：EVO 通过靶向肝星状细胞中的 ANXA2-p110α 轴缓解肝纤维化。
01
研究背景及科学问题
肝纤维化是慢性肝病进展为肝硬化和肝细胞癌过程中的关键病理阶段。目前，肝纤维化的治疗仍主要集中在病因干预层面，而能够直接减缓纤维化进展的治疗方法仍十分有限。在中国临床实践中，常用中药复方如安络化纤丸、扶正化瘀胶囊和鳖甲软肝片联合抗病毒治疗，已被报道较单纯抗病毒治疗更有助于延缓肝纤维化进展。肝星状细胞的活化和增殖是细胞外基质沉积及纤维化进展的关键驱动因素，因此活化的肝星状细胞被认为是肝纤维化治疗的重要靶点。鉴于天然产物在小分子药物发现中的重要价值，从临床有效的抗纤维化中药复方中系统筛选能够抑制肝星状细胞活化的天然化合物，是发现新型抗纤维化先导化合物的一种合理策略。
吴茱萸碱（EVO）是一种从 Tetradium ruticarpum（A.Juss.）T.G.Hartley 中分离得到的吲哚类生物碱，具有抗炎、抗肿瘤和代谢调节作用。越来越多的证据显示，EVO 在多个器官中具有抗纤维化活性。例如，EVO 可通过调节 apelin 信号缓解脂多糖诱导的肺纤维化；也可抑制 TGF-β1 诱导的心脏成纤维细胞活化和内皮-间充质转化，从而减轻心肌纤维化。此外，少数研究提示 EVO 可能通过下调 TGF-β1/Smad 信号，减轻肝星状细胞活化和胶原沉积。然而，这些研究主要描述了 EVO 的药效和下游通路变化，其在肝星状细胞中的直接分子靶点仍不清楚。
膜联蛋白 A2（ANXA2）是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，参与膜结构组织、细胞骨架重塑和信号转导。在临床样本中，慢性乙型肝炎患者血清 ANXA2 水平升高；在非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎中，肝脏 ANXA2 表达升高，并与纤维化严重程度相关。与此一致，在 CCl₄ 诱导的肝纤维化和饮食诱导的脂肪肝疾病等实验模型中，也观察到 ANXA2 上调。PI3K-AKT 通路是驱动肝星状细胞活化和纤维化进展的重要信号节点。已有研究提示 ANXA2 与 PI3K-AKT 相关信号网络有关。例如，TIM-4 与 ANXA2 的相互作用可促进 PI3K-AKT 激活和肺癌进展；敲低 ANXA2 则可抑制肝星状细胞中的 PI3K-AKT 激活。然而，ANXA2 是否在肝星状细胞中直接与 PI3K 组分偶联，从而调控 PI3K-AKT 活化，目前仍不明确。
因此，本研究旨在从 3 种临床常用的抗纤维化中药复方中筛选作用于肝星状细胞的天然化合物。通过整合筛选和多模型验证策略，研究从 23 个优先候选化合物中确定 EVO 是具有稳定抗纤维化活性的先导候选物。进一步的靶点验证研究表明，ANXA2 是 EVO 在肝星状细胞中的直接靶点。机制上，EVO 可促进 NEDD4L 介导的 ANXA2 泛素化和蛋白酶体降解，并破坏 ANXA2-p110α 相互作用，从而抑制 PI3K-AKT 信号。通过这种双重抑制作用，EVO 抑制肝星状细胞活化并缓解肝纤维化，为后续抗纤维化药物开发提供了基础。
02
重要发现及亮点
EVO 在体外抑制肝星状细胞增殖与活化
研究首先建立了天然小分子抗纤维化潜力的筛选流程。研究人员从 TCMSP 和 HERB 数据库中挖掘安络化纤丸、扶正化瘀胶囊和鳖甲软肝片的化学成分，分别获得 752、683 和 1058 个化合物。进一步根据类药性和 SwissADME 预测的药代动力学性质进行筛选后，候选化合物分别缩小至 30、62 和 47 个。随后，研究整合了来自代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD，既往称为 NAFLD）、酒精性肝病（ALD）和乙型肝炎病毒（HBV）相关肝纤维化转录组数据集中的 2537 个纤维化相关差异表达基因，并与 1136 个预测化合物靶点取交集，获得 180 个共同靶点。蛋白互作网络分析进一步筛选出 62 个枢纽靶点，并从化合物-枢纽靶点网络中选择 23 个高度连接的化合物用于后续体外筛选。
在 TGF-β1 激活的 LX-2 细胞中，RT-qPCR 筛选显示 EVO、大黄素、甜橙黄酮、山柰酚和小檗碱均可明显降低 COL1A1 和 ACTA2（α-SMA）mRNA 表达。进一步的蛋白水平验证显示，在这些候选化合物中，含吲哚结构的生物碱 EVO 具有最显著的抑制作用。剂量反应实验显示，在 LX-2 和 HSC-T6 细胞中，10 μM EVO 在不明显影响细胞活力的情况下，对 collagen I 和 α-SMA 蛋白表达的抑制最强，因此被选为后续实验的最佳浓度。此外，EVO 还能逆转 TGF-β1 诱导的 LX-2 细胞形态变化，降低 LX-2、HSC-T6 和原代肝星状细胞中的 α-SMA 免疫荧光信号，并通过 IncuCyte 活细胞成像和 EdU 掺入实验显示出对 LX-2 细胞增殖的抑制作用。与此一致，EVO 还降低了 LX-2 和 HSC-T6 细胞中 PCNA 与 CCND1 的表达，并减少原代肝星状细胞中 collagen I 和 α-SMA 的蛋白水平。总体而言，这些结果表明，EVO 是抑制肝星状细胞活化和增殖最有效的候选化合物。
图1：EVO 的鉴定及体外验证。（A）整合网络药理学和 LX-2 细胞筛选以鉴定 EVO 的工作流程。（B）在 TGF-β1 刺激的 LX-2 细胞中，使用 23 个候选化合物（10 μM）处理后，纤维化相关 mRNA 表达的 RT-qPCR 热图（n = 3）。（C）LX-2 细胞经 5 个候选化合物处理后，α-SMA 和 Collagen I 的代表性 Western blot 结果。（D）EVO 的化学结构。（E）使用 IncuCyte 系统测定的肝星状细胞标准化融合度。（F）活细胞成像及代表性形态图像，显示 EVO（5 μM 和 10 μM）对 TGF-β1 处理的肝星状细胞的影响。比例尺：20 μm。（G）EdU 掺入实验显示各组细胞增殖情况；DAPI 标记细胞核，EdU 标记增殖细胞。比例尺：50 μm。数据以均值 ± SEM 表示。统计学显著性采用单因素方差分析并进行 Tukey 事后检验。*P < 0.05，**P < 0.01，与 TGF-β1 组相比；## < 0.001，与 Con 组相比。
EVO 在多种小鼠肝纤维化模型中缓解肝纤维化
为了评价 EVO 的体内抗纤维化作用，研究采用了 3 种小鼠肝纤维化模型：CCl₄ 诱导的肝纤维化、DDC 诱导的胆汁淤积性纤维化，以及 HFD+CCl₄ 诱导的代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）相关纤维化。
根据既往体内给药方案，研究在 CCl₄ 诱导的肝纤维化模型中选择 25、50 和 100 mg/kg 作为低、中、高剂量进行初步剂量评估，并以临床使用的抗纤维化中药制剂安络化纤丸作为阳性对照。网络药理学预测和 LC-MS/MS 注释结果均提示 EVO 是安络化纤丸中的化学成分。与 CCl₄ 组相比，不同剂量 EVO 和安络化纤丸均在不同程度上降低血清 ALT 和 AST 水平，减轻组织学肝损伤和胶原沉积，并降低 α-SMA 表达。与此一致，肝组织羟脯氨酸含量降低，肝硬化发生率从 76.7% 降至 22.0%–48.0%。25 mg/kg 和 50 mg/kg EVO 呈剂量依赖性改善，而 50 mg/kg 与 100 mg/kg 之间未见显著差异。50 mg/kg 和 100 mg/kg EVO 的改善效果均优于安络化纤丸。值得注意的是，50 mg/kg EVO 在肝组织 mRNA 和蛋白水平上均显著下调 Col1a1、Acta2 和 TGF-β。因此，研究在后续实验中采用 25 mg/kg 和 50 mg/kg 两个剂量。
在 DDC 诱导的纤维化模型中，EVO 以剂量依赖方式降低肝重/体重比以及血清 ALT、AST 和 TBA 水平。组织学分析显示，EVO 减少胆管周围胶原积累和卟啉沉积，同时降低 α-SMA 表达。肝组织羟脯氨酸含量和纤维化相关蛋白水平也相应下降。在 HFD+CCl₄ 诱导的纤维化模型中，EVO 明显降低血清 ALT 和 AST 水平，减轻肝损伤，减少胶原和脂质沉积，并降低肝脏硬度。EVO 还降低肝组织羟脯氨酸含量，使纤维化分级向较低阶段转移，在蛋白水平下调 TGF-β、α-SMA 和 collagen I，并改善脂肪变性评分。此外，EVO 显著降低 TC、TG 和 LDL-C 水平，并改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。
总体来看，EVO 在 3 种模型中均表现出一致的抗纤维化作用。在所测试的剂量范围内，肾功能指标未见明显异常，包括心、肺、脾、肾在内的主要器官也未观察到明显毒性或组织病理学异常。
图2：EVO 在多种小鼠模型中缓解肝纤维化。（A）CCl₄ 诱导小鼠纤维化模型实验设计示意图。（B）CCl₄ 诱导纤维化模型中血清 ALT 和 AST 水平（n = 6–8）。（C）各组小鼠肝组织 H&E、Masson 和 α-SMA 染色的代表性图像。比例尺：200 μm。（D）DDC 诱导小鼠纤维化模型实验设计示意图。（E）DDC 诱导纤维化模型中血清 ALT、AST、TBIL、ALP 和 TBA 水平（n = 3–6）。（F）HFD+CCl₄ 诱导小鼠纤维化模型实验设计示意图。（G）HFD+CCl₄ 诱导纤维化模型中血清 ALT 和 AST 水平（n = 3–5）。（H）各组小鼠肝组织 H&E、Sirius Red 和 Oil Red O 染色的代表性图像。比例尺：200 μm。（I）各组小鼠肝脏超声弹性成像的代表性图像。数据以均值 ± SEM 表示。统计学显著性采用单因素方差分析并进行 Tukey 事后检验。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，与 CCl₄ 组、DDC 组或 HFD+CCl₄ 组相比；# < 0.01，## < 0.001，与 Con 组相比。ns 表示差异无统计学意义。
ANXA2 被鉴定为 EVO 的直接作用靶点
为了鉴定 EVO 的分子靶点，研究采用 DARTS 蛋白质组学分析。在被保护的约 35–40 kDa 蛋白区域中，LC-MS/MS 鉴定出 16 个候选蛋白，其中 ANXA2 排名最高，评分为 83.5。进一步将 EVO 处理组与对照组之间的强度变化，与 MASLD、ALD 和 HBV 相关纤维化转录组数据集交叉分析，候选靶点缩小为 4 个：ALDOC、ANXA2、BUB3 和 IKBIP。其中，ANXA2 在 EVO 与对照之间的强度变化明显，并且在多个公开 GEO 数据集中随纤维化进展呈一致上调。
多种相互独立的实验进一步支持 EVO 与 ANXA2 存在相互作用。分子对接预测 EVO 可结合在 ANXA2 N 端附近，并涉及 Ser22 和 Val27 位点，结合能为 -6.7 kcal/mol；BLI 进一步证实二者呈浓度依赖性结合，解离常数 Kᴰ 为 60.25 μM。在 DARTS-Western blot 实验中，EVO 提高了 ANXA2 对蛋白酶消化的抵抗能力；细胞热转变分析（CETSA）显示 EVO 增强了 ANXA2 的热稳定性。为了验证预测的结合残基，研究采用带 Flag 标签的野生型 ANXA2 以及 Ser22/Val27 突变型 ANXA2 进行 CETSA 分析，结果显示双突变可消除 EVO 诱导的 ANXA2 热稳定性增强，提示 Ser22 和 Val27 是 EVO 与 ANXA2 结合的关键残基。公开 GEO 数据集进一步显示，在 MASLD、ALD 和 HBV 相关纤维化患者中，ANXA2 表达随纤维化严重程度升高而增加。在 HBV 数据集中，ANXA2 表达与 COL1A1、ACTA2 以及纤维化分期呈正相关。临床肝组织标本同样显示，ANXA2 表达随纤维化分期加重而升高。综合来看，这些结果支持 ANXA2 是 EVO 的直接结合靶点。
图3：EVO 直接靶向 ANXA2。（A）DARTS 联合 LC-MS/MS 用于靶点鉴定的流程示意图。（B）LX-2 细胞中 DARTS 实验的银染结果。（C）质谱分析鉴定出的前 8 个候选靶点。（D）整合 DARTS 命中蛋白与纤维化相关 GEO 转录组数据集（MASLD/ALD/HBV）进行候选靶点筛选。（E）EVO 与 ANXA2 的分子对接结果。（F）BLI 分析 EVO 与 ANXA2 的结合。（G）在有或无 EVO（50 μM）条件下，用不同剂量蛋白酶消化 LX-2 细胞裂解物，随后通过 Western blot 检测 ANXA2 蛋白水平。（H）EVO（50 μM）处理后 ANXA2 的 CETSA 分析。（I）CETSA 分析 EVO（50 μM）与野生型 ANXA2（Flag-ANXA2WT）或 Ser22/Val27 突变型 ANXA2（Flag-ANXA22A）在细胞内的结合。（J）根据纤维化分期/分级分层的公开转录组队列中 ANXA2 表达情况；下方图显示在 GSE84044 队列中，ANXA2 表达与纤维化相关标志物 ACTA2 和 COL1A1 以及纤维化分期之间的 Spearman 相关分析。（K）不同纤维化分期人肝组织中 ANXA2 免疫组织化学染色的代表性图像。比例尺：50 μm。转录组数据的统计学分析按方法部分所述进行。相关性采用 Spearman 秩相关检验评估。
EVO 通过靶向 ANXA2 抑制肝星状细胞活化并缓解肝纤维化
在 CCl₄ 诱导的纤维化小鼠肝脏和肝硬化人肝组织的单细胞 RNA 测序分析中，ANXA2 在活化的肝星状细胞中富集。这些活化肝星状细胞由 COL1A1、COL1A2 和 TIMP1 等细胞外基质相关标志物识别。与此一致，TGF-β1 可提高 LX-2 细胞中 ANXA2 的表达，而 EVO 则抑制 ANXA2 上调。在 CCl₄、DDC 和 HFD+CCl₄ 诱导的纤维化模型中，ANXA2 蛋白水平均明显升高，并被 EVO 降低。尽管已有研究提示肝细胞中的 ANXA2 参与 MASLD/MASH 进展，但在本研究的纤维化模型中，ANXA2 染色主要富集于 α-SMA 阳性区域，提示其与活化肝星状细胞密切相关。
为了检验 EVO 的抗纤维化作用是否依赖 ANXA2，研究开展了挽救实验。在体外实验中，EVO 处理和 ANXA2 敲低均可抑制 TGF-β1 诱导的促纤维化蛋白表达，而 ANXA2 过表达可部分逆转 EVO 的抑制作用。在 CCl₄ 模型中，研究使用 AAV6-Postn 载体，使 ANXA2 主要在活化肝星状细胞/肌成纤维细胞区室中过表达。EGFP 报告信号显示，ANXA2 过表达主要位于 α-SMA 阳性纤维化区域。与 CCl₄ 组相比，ANXA2 过表达与血清 ALT 和 AST 持续升高、肝组织结构破坏加重、胶原沉积增加以及 α-SMA 阳性区域扩大有关。肝组织羟脯氨酸含量以及 α-SMA 和 collagen I 水平也呈上升趋势。EVO 可明显减轻肝损伤和纤维化，但 ANXA2 过表达会部分削弱这些获益。此外，ANXA2 抑制剂 LCKLSL 可减轻 CCl₄ 模型中的组织学纤维化，进一步支持 ANXA2 在肝纤维化进展中的促纤维化作用。
图4：EVO 通过 ANXA2 抑制肝星状细胞活化，从而缓解肝纤维化。（A）UMAP 特征图显示公开小鼠肝脏单细胞 RNA 测序数据集（GSE171904）中 ANXA2 及纤维化相关标志物 COL1A1、COL1A2、TIMP1 的表达。（B）CCl₄、DDC 和 HFD+CCl₄ 模型肝组织中 ANXA2 的代表性 Western blot 结果（n = 3）。（C）各模型及处理组肝切片中 ANXA2（绿色）和 α-SMA（红色）与 DAPI（蓝色）的代表性免疫荧光染色图像。比例尺：50 μm。（D）CCl₄ 模型中 AAV6-ANXA2 递送及药物处理（EVO 或 LCKLSL）的示意图。（E）各组血清 ALT 和 AST 水平（n = 3–5）。（F）各组小鼠肝组织 H&E、Sirius Red 和 α-SMA 染色的代表性图像。比例尺：200 μm。数据以均值 ± SEM 表示。统计学显著性采用单因素方差分析并进行 Tukey 事后检验。**P < 0.01，与 CCl₄ 组相比；# < 0.01，与 Con 组相比；&&P < 0.01，与 EVO 组相比。
EVO 促进 NEDD4L 介导的 ANXA2 K48 连接泛素化与蛋白酶体降解
为了探究 EVO 如何调控 ANXA2 蛋白水平，研究检测了 ANXA2 mRNA 表达及翻译后蛋白稳定性。RT-qPCR 结果显示，在 TGF-β1 处理的 LX-2 细胞中，ANXA2 mRNA 水平没有显著变化；而环己酰亚胺（CHX）追踪实验显示，EVO 处理降低了 ANXA2 蛋白稳定性，并加速其降解。值得注意的是，EVO 结合残基 Ser22 和 Val27 突变后，EVO 诱导的 ANXA2 降解被减弱。既往研究提示 ANXA2 可通过泛素-蛋白酶体途径降解，但 EVO 是否促进 ANXA2 泛素化仍不清楚。因此，研究分别使用 MG132 和 CQ 阻断蛋白酶体和溶酶体途径。结果显示，MG132 可拮抗 EVO 诱导的 ANXA2 下调，而 CQ 无明显影响。此外，EVO 明显增加 ANXA2 多聚泛素化，提示 EVO 增强了 ANXA2 的泛素依赖性蛋白酶体周转。
泛素化过程中的底物特异性主要由 E3 泛素连接酶决定。为了鉴定负责 ANXA2 降解的关键 E3 连接酶，研究利用 UbiBrowser 预测可能与 ANXA2 相互作用的 E3 连接酶，并选择排名前 10 的候选者。将预测结果与 RNA-seq 数据整合后发现，在 TGF-β1 处理的 LX-2 细胞中，EVO 显著上调 NEDD4L mRNA。敲低 NEDD4L 可恢复 EVO 处理下的 ANXA2 蛋白水平，提示 NEDD4L 对 EVO 诱导的 ANXA2 降解是必需的。共免疫沉淀进一步显示，EVO 增强了 ANXA2 与 NEDD4L 之间的相互作用。由于已有研究报道 ANXA2 可被 K48 和 K63 多聚泛素链修饰，研究进一步检测了这两类泛素链。结果显示，EVO 增强了 ANXA2 上的 K48 泛素链，而 K63 泛素链基本无变化。更重要的是，NEDD4L 敲低降低了 EVO 诱导的 ANXA2 K48 连接泛素化。总体而言，这些数据表明，EVO 通过 NEDD4L 介导的 K48 连接泛素化促进 ANXA2 降解。
图5：EVO 促进 NEDD4L 介导的 ANXA2 泛素化和蛋白酶体降解。（A）RT-qPCR 分析 LX-2 细胞在指定条件下处理 24 h 后 ANXA2 mRNA 水平（n = 3）。（B）在 EVO（10 μM）处理后，于指定时间点进行环己酰亚胺追踪实验（CHX；25 μg/mL），评估 ANXA2 蛋白稳定性，随后进行 Western blot 检测。（C）在 EVO（10 μM）处理后，于指定时间点进行环己酰亚胺追踪实验（CHX；25 μg/mL），评估带 Flag 标签的野生型 ANXA2（Flag-ANXA2WT）或 Ser22/Val27 突变型 ANXA2（Flag-ANXA22A）的蛋白稳定性，随后进行 Western blot 检测。（D–E）在蛋白酶体抑制剂 MG132（10 μM）或溶酶体抑制剂 CQ（50 μM）存在条件下，LX-2 细胞经 EVO（10 μM）处理后 ANXA2 的代表性 Western blot 结果。（F）在 EVO（10 μM）处理的 LX-2 细胞中，通过 Co-IP 检测 ANXA2 泛素化。（G）ANXA2 相关 E3 连接酶的生物信息学预测以及基于 RNA-seq 的 mRNA 表达变化。（H）代表性 Western blot 显示 NEDD4L 敲低对 EVO（10 μM）处理的 LX-2 细胞中 ANXA2 蛋白水平的影响。（I）Co-IP 实验用于评估 EVO（10 μM）对 LX-2 细胞中内源性 ANXA2 与内源性 NEDD4L 相互作用的影响。（J–K）通过 Co-IP 后分别检测 K48 连接 Ub（J）或 K63 连接 Ub（K）的免疫印迹，评估指定条件下 ANXA2 的泛素链连接类型特异性泛素化。（L）在有或无 NEDD4L 敲低条件下，EVO（10 μM）处理后通过 Co-IP 并检测 K48 连接 Ub，评估 ANXA2 的 K48 连接泛素化。数据以均值 ± SEM 表示。统计学显著性采用单因素方差分析并进行 Tukey 事后检验。ns 表示差异无统计学意义。
EVO 以 ANXA2 依赖方式抑制 PI3K-AKT 信号
为了探究 EVO 如何通过 ANXA2 改善肝纤维化，研究利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析筛选下游信号。EVO 预测靶点与 MASLD、ALD 和 HBV 相关纤维化数据集中的纤维化相关基因富集分析均一致指向 PI3K-AKT 通路。单细胞分析进一步支持这一信号：区分活化肝星状细胞与静息肝星状细胞的基因显著富集于 PI3K-AKT 信号通路，提示该通路与肝星状细胞活化状态密切相关。与这些观察结果一致，在 TGF-β1 刺激的 LX-2 细胞中，RNA-seq 显示 EVO 处理和 ANXA2 敲低均显著影响 PI3K-AKT 信号相关基因集。
RNA-seq 进一步显示，EVO 处理和 ANXA2 敲低均降低了 COL1A1、COL3A1 和 ACTA2 等纤维化相关转录本的表达。值得注意的是，这两种处理均未降低编码 PI3K 催化亚基和调节亚基的基因 mRNA 水平，包括 PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD 以及 PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3；其抑制作用更多体现在下游或功能性通路基因，如 AKT、CDK 等。RT-qPCR 结果与 RNA-seq 数据趋势一致。虽然 PI3K 亚基转录本未下降，但 EVO 处理或 ANXA2 敲低抑制了 p-PI3K 水平，并显著降低总 AKT 和 p-AKT，联合处理时效果更强。相反，ANXA2 过表达可部分逆转 EVO 对这些蛋白的抑制作用。与此一致，EVO 在细胞和多种纤维化小鼠模型中均抑制 PI3K-AKT 激活。
为了验证 PI3K-AKT 信号是 EVO 的下游作用通路，研究进行了药理学扰动实验。PI3K 抑制剂 LY294002 可模拟 EVO 的作用，抑制 PI3K-AKT 激活并减轻促纤维化表型。相反，PI3K 激动剂 740Y-P 可部分抵消 EVO 介导的通路抑制，并削弱 EVO 诱导的抗纤维化反应。这些发现提供了功能性证据，说明 PI3K-AKT 信号是 EVO-ANXA2 轴调控肝星状细胞活化和纤维化输出的重要下游通路。
图6：EVO 通过 ANXA2 抑制 PI3K-AKT 信号。（A）EVO 相关靶点的 KEGG 通路富集分析。（B–D）HBV（B）、ALD（C）和 MASLD（D）GEO 队列中纤维化相关差异表达基因的 KEGG 通路富集分析。（E）来自单细胞 RNA 测序和 RNA-seq 的差异表达基因 KEGG 富集分析。（F–G）热图显示在指定条件下 LX-2 细胞中纤维化相关基因（F）和 PI3K-AKT 通路组分（G）的 mRNA 表达变化。（H）LX-2 细胞转染 siANXA2-1 或 siANXA2-2，并在有或无 EVO（10 μM）条件下处理 48 h，随后对指定蛋白进行免疫印迹检测（n = 3）。（I）LX-2 细胞转染 OE-ANXA2，并在有或无 EVO（10 μM）条件下处理 48 h，随后对指定蛋白进行免疫印迹检测（n = 3）。（J–K）LX-2 细胞使用 PI3K 抑制剂 LY294002（J）或 PI3K 激活剂 740Y-P（K）处理，同时有或无 EVO（10 μM）共同处理 24 h，随后对指定蛋白进行免疫印迹检测（n = 3）。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，与 TGF-β1 组相比。
EVO 破坏肝星状细胞中的 ANXA2-p110α 相互作用
PI3K-AKT 信号参与肝星状细胞活化和纤维化进展，而 PI3K 激活可由上游信号在质膜处启动。考虑到 ANXA2 具有膜定位特性，研究提出假设：ANXA2 可能作为连接 EVO 与 PI3K 激活的介质。分子对接分析提示，ANXA2 更倾向于与 PI3K 催化亚基 p110α（PIK3CA）相互作用，涉及 Asn345、Ser379、Arg382 和 His450 等残基，其得分/置信度和构象稳定性高于其他催化亚型 PIK3CB、PIK3CD 或调节亚基 PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3。
共免疫沉淀证实，内源性 ANXA2 与 p110α 之间存在相互作用，而 EVO 处理可削弱这种相互作用。与此一致，Flag-IP 实验显示，EVO 减弱 p110α 与野生型 ANXA2 的相互作用，而在 Ser22/Val27 突变型 ANXA2 构建体中，这种抑制作用被减弱，提示 Ser22/Val27 区域参与 EVO 对 ANXA2-p110α 复合物形成的干扰。使用重组蛋白进行 BLI 分析显示，ANXA2 与 p110α 呈浓度依赖性相互作用。预先将 ANXA2 与 250–1000 μM EVO 孵育，可剂量依赖性降低结合响应，表现为结合信号降低和最大结合水平下降。相比之下，不同 EVO 条件下的解离曲线大体相似，提示 EVO 主要限制 ANXA2-p110α 复合物形成，而不是在结合发生后显著加速其解离。
在功能层面，EVO 处理和 ANXA2 敲低均降低 TGF-β1 激活的 LX-2 细胞中 p110α 蛋白水平，联合处理时降低更明显。相反，ANXA2 过表达或 PI3K 激动剂 740Y-P 可部分恢复 EVO 处理下 p110α 蛋白丰度。CHX 追踪实验进一步显示，ANXA2 敲低加速 p110α 蛋白降解，提示 ANXA2 有助于维持 p110α 蛋白稳定性。与此一致，EVO 在活化 LX-2 细胞和多种纤维化小鼠模型中均降低 p110α 蛋白丰度。在 CCl₄ 诱导的纤维化肝脏中，多色免疫荧光显示，ANXA2 和 p110α 在 α-SMA 阳性星状细胞中共定位，而 EVO 处理显著降低这种共定位。总体而言，这些结果表明，EVO 可直接干扰 ANXA2-p110α 复合物形成，同时 ANXA2 也参与维持 p110α 蛋白稳定性。
图7：EVO 破坏肝星状细胞和纤维化肝脏中的 ANXA2-p110α 轴。（A）ANXA2 与 p110α 的分子对接结果。（B）Co-IP 实验用于评估 EVO（10 μM）对 LX-2 细胞中内源性 ANXA2 与内源性 p110α 相互作用的影响。（C）Co-IP 实验用于评估 EVO（10 μM）对 LX-2 细胞中 p110α 与带 Flag 标签的野生型 ANXA2（Flag-ANXA2WT）或 Ser22/Val27 突变型 ANXA2（Flag-ANXA22A）相互作用的影响。（D）基于 BLI 的 ANXA2 与 p110α 结合实验示意图。（E）在指定 ANXA2 浓度下，BLI 分析 ANXA2 与 p110α 的结合。（F）在有或无指定浓度 EVO 条件下，BLI 分析 ANXA2 与 p110α 的结合。（G）LX-2 细胞转染 siANXA2-1 或 siANXA2-2，并在有或无 EVO（10 μM）条件下处理 48 h，随后通过免疫印迹检测 p110α（n = 3）。（H）LX-2 细胞转染 OE-ANXA2，并在有或无 EVO（10 μM）条件下处理 48 h，随后通过免疫印迹检测 p110α（n = 3）。（I）在 ANXA2 敲低后，于指定时间点进行环己酰亚胺追踪实验（CHX；25 μg/mL），评估 p110α 蛋白稳定性，随后进行 Western blot 检测。（J）各组肝切片中 ANXA2（绿色）、α-SMA（红色）、p110α（品红色）和 DAPI（蓝色）的代表性多重免疫荧光染色图像。比例尺：100 μm（n = 3）。
机制示意图总结
结合上述结果，研究提出 EVO 缓解肝纤维化的关键机制：EVO 直接靶向 ANXA2，一方面促进 NEDD4L 介导的 ANXA2 K48 连接泛素化和蛋白酶体降解，另一方面破坏 ANXA2 与 PI3K 催化亚基 p110α 的相互作用，从而抑制 PI3K-AKT 信号，最终降低肝星状细胞的增殖与活化，并减轻肝纤维化。
图8：示意图总结 EVO 如何缓解肝星状细胞活化和肝纤维化。
【贡献】★★★★★
总之，本研究揭示了一种此前尚未认识到的机制：EVO 通过靶向 ANXA2，促进其泛素依赖性降解，并破坏 ANXA2-p110α 相互作用，从而抑制 PI3K-AKT 信号并缓解肝纤维化。这些发现支持 EVO 作为一种抗纤维化候选化合物，并为理解肝纤维化中的 EVO-ANXA2-p110α 轴提供了新的机制依据。
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