Nat Biotechnol | 杨朝勇/许醒/宋彦龄团队提出组织细胞外囊泡空间解析新技术|t细胞|免疫性疾病|宋彦龄|微环境|杨朝勇|许醒

细胞外囊泡是细胞释放至胞外的纳米级信使，携带蛋白质、核酸等生物活性分子，在细胞间通讯、肿瘤进展和免疫调控中发挥关键作用。然而，传统分析方法依赖组织解离和差速离心，这些处理会破坏EV在组织中的天然空间分布，使得我们只能看到“有哪些EV”，却无法知道它们“从哪里来”“在什么位置”“与谁对话”。如何在保留空间位置的前提下实现EV的高分辨分子分型与功能解析，是该领域的长期技术挑战。

2026年6月26日，厦门大学杨朝勇、福建医科大学许醒和厦门大学宋彦龄团队在Nature Biotechnology上发表了文章Spatially resolved profiling of extracellular vesicles in tissues with Spatial-EV-seq，报道了组织细胞外囊泡空间解析新技术Spatial-EV-seq，提出了空间EV生物学新概念，首次实现了EV在组织中的“位置-身份-功能”联合解析（图1）。该技术在不破坏组织空间结构的前提下，原位捕获EV、鉴定其分子身份，并进一步与细胞空间转录组图谱进行跨尺度耦合，突破了微环境中EV空间分布及其与细胞互作信息缺失的壁垒。

研究者首先在载玻片上构建了抗体功能化的捕获界面，将冷冻组织切片与界面紧密贴合后，基于转印技术通过抗原-抗体相互作用实现EV的垂直转移，同时完整保留了其在组织中的原始空间坐标，就像用复写纸将EV的位置“拓印”下来。为验证空间保真度，研究者加入外源性荧光标记EV进行定量评估，结果显示EV的侧向扩散极小（仅约5.8微米）。由于EV尺寸极小（约100纳米），无法直接成像，研究采用了滚环扩增技术，以能够特异性识别EV表面靶蛋白的修饰适配体作为引物启动滚换扩增反应形成DNA纳米花结构，随后与荧光标记的检测探针杂交，产生可在显微镜下清晰分辨的明亮斑点。与传统抗体偶联荧光检测相比，该方法的信号强度提升逾10倍。为将EV的空间分布与其来源细胞和靶细胞相关联，研究者进一步将Spatial-EV-seq与空间转录组测序结合，通过图像配准算法实现两种数据的精准对齐，使EV的位置信息与周围细胞的转录状态一一对应。

图1 Spatial-EV-seq工作原理示意图

在组织EV转印环节，研究者可根据实验条件选择两种操作方式（图2）：一种是将组织切片玻片与捕获界面直接紧密贴合，通过抗原-抗体相互作用实现EV的垂直转移；另一种是借助DynaBlot空间组学转印仪完成转印过程，该仪器采用高精度贴合与控温技术，可在保持组织完整性的同时实现EV的高效、稳定、高保真垂直转移，有效抑制分子弥散，保障空间定位的精准度与实验可重复性。两种方式均可有效实现EV的原位捕获与空间保真转移。

图2 组织细胞外囊泡转印示意图

利用Spatial-EV-seq技术，研究者重点关注PD-L1⁺ EV与CD8⁺ T细胞的空间关联。在治疗前的肿瘤样本中，根据PD-L1⁺ EV的丰度将CD8⁺ T细胞分为两组：Cluster 1与高丰度PD-L1⁺ EV共定位，Cluster 2与低丰度PD-L1⁺ EV共定位。GO分析显示，Cluster 1显著富集于T细胞分化与免疫抑制相关通路，而Cluster 2则与肿瘤发生相关通路关联更为密切。配体-受体互作分析表明，Cluster 1内耗竭型CD8⁺ T细胞（CD8Tex）的受体互作显著多于功能性CD8⁺ T细胞，提示PD-L1⁺ EV可通过持续性抑制信号诱导T细胞耗竭；相反，Cluster 2中以CD8⁺ T细胞主导的配体-受体活性为主，EV介导的免疫抑制作用较弱。在免疫治疗后的样本中，Cluster 1主要富集于代谢重编程相关通路，Cluster 2则显著富集于I型干扰素产生等免疫活化通路。值得注意的是，研究还发现PD-L1基因表达与PD-L1⁺ EV分布存在空间解离，即某些区域PD-L1⁺ EV高丰度但CD274 mRNA低表达，且伴随大量耗竭性CD8⁺ T细胞聚集。这意味着EV携带的PD-L1并非来自当地细胞的“现场生产”，而是由远处肿瘤细胞分泌后迁移至此，独立于细胞表面PD-L1发挥免疫抑制作用。综合所有样本的分析结果，无论在治疗前还是治疗后，PD-L1⁺ EV高丰度区域均与免疫抑制相关，核心特征为CD8⁺ T细胞耗竭；而PD-L1⁺ EV低丰度区域则对抗PD-1免疫治疗产生应答，并在治疗后维持免疫活化状态。

图3 PD-L1⁺ EV与CD8⁺ T细胞的空间关联

研究者进一步将该技术应用于肝癌异种移植瘤、乳腺癌PDX模型以及临床肝癌穿刺样本，均成功绘制了关键EV亚型的空间分布图谱，证明了该技术在不同组织类型和物种中的广泛适用性。

Spatial-EV-seq的建立标志着EV研究从“混合匀浆”走向“原位空间解析”的范式转变，使研究者首次能够在天然微环境中同时获取EV的空间位置、分子身份与功能关联信息，为理解肿瘤微环境中EV介导的免疫逃逸与治疗耐药机制开辟了新视角。该技术具备高度灵活的设计空间和强大的多组学整合能力，有望成为未来空间生物学研究的重要工具，为精准诊断和新型疗法开发提供技术支撑。