Amyloid β-Peptide (1-42)（Aβ1-42）是由42个氨基酸组成的β-淀粉样蛋白肽段，由淀粉样前体蛋白（APP）经β-分泌酶和γ-分泌酶顺序切割而成。Aβ1-42被认为是与动物阿尔茨海默病（AD）相关度最高的致病因子，也是构建大/小鼠等AD动物模型的热门工具肽[1]。

一、Amyloid β-Peptide (1-42) 寡聚体/纤维体的制备方案

Amyloid β-Peptide (1-42)（β-Amyloid (1-42)）单体的神经毒性有限，难以诱导AD模型，主要以多种寡聚体或纤维体的形式发挥功能，包括可溶性寡聚体（Oligomers）、原纤维（Protofibrils）和成熟纤维（Fibrils），其中可溶性寡聚体被认为是神经毒性最强的形式，能诱导动物脑组织中的突触功能障碍、氧化应激、神经炎症及神经元死亡。因此在动物注射之前，建议制备好Aβ1-42寡聚体或聚集体。一般主流的制备方法有以下三种：

1. HFIP-DMSO法制备Amyloid β-Peptide (1-42) 寡聚体和纤维体（经典方法）

  • 单体化处理：将冻干的Amyloid β-Peptide (1-42)（β-Amyloid (1-42)）在室温下平衡30分钟，用六氟异丙醇（HFIP）溶解至终浓度为1 mM，涡旋数秒。将溶液分装至低吸附聚丙烯离心管中，室温孵育2小时以促进单体化。随后真空干燥以去除掉所有HFIP，将得到的多肽以薄膜形式保存在-20或-80℃。

  • 寡聚体制备：将上述的Amyloid β-Peptide (1-42)（Aβ1-42）单体化肽膜用无水二甲基亚砜（DMSO）溶解至终浓度5 mM，然后用灭菌双蒸水稀释到适当的浓度（eg: 200 μM），涡旋确保溶清。接下来，该溶液在4 ~ 8℃下老化24 ~ 48h。然后在4-8 ℃下以14000g离心10分钟；此时，可溶性低聚物在上清液中。将上清液稀释10-200倍用于后续实验。

  • 纤维体制备：如需制备纤维体则可将上述经单体化处理所得的肽膜溶解于无水 DMSO中，浓度为 5 mM，然后用缓冲液（10 mM HCl）涡旋并稀释至一定浓度，随后在37℃下老化24 ~ 48小时，得到Aβ1-42纤维体[2]。

  • 在使用HFIP溶解Aβ1-42肽时，如有少量不溶物，可延长HFIP处理时间 (如过夜孵育)、涡旋震荡、或辅助短时间超声；如仍有少量不溶物，建议离心或过滤去除。

  • 如果没有真空干燥条件，可以尝试氮吹，不建议冷冻干燥或置于通风橱内自然挥发。

  • 若使用 PBS 稀释，可能会导致多肽析出。

  • 聚集形式在溶液中不稳定，建议现配现用。如需储存，建议以薄膜形式的肽储存在 -20°C 或 -80°C。

二、模式动物的选择

1. 啮齿类动物

  • 小鼠品系：

C57BL/6J是目前Aβ1-42（CAS No.：107761-42-2）诱导的AD模型中最常用的近交系小鼠，该品系小鼠学习记忆能力良好，对Morris水迷宫、新物体识别等测试基线稳定。

ICR是广泛使用的远交系（封闭群）小鼠，相较于C57BL/6，ICR小鼠体型更大，脑区解剖标志更清晰，立体定位手术操作更为便利，且攻击性行为少，适合长期行为学观察和反复操作。

BALB/c也是常用的近交系小鼠，适合研究Aβ1-42诱导的神经炎症反应、小胶质细胞活化等免疫相关机制的研究。需要注意的是BALB/c小鼠较为胆小，对新环境应激反应较强，行为学测试需充分适应。

APP/PS1及5xFAD转基因小鼠也可在基因编辑的基础上叠加β-Amyloid (1-42)注射，主要用于模拟Aβ负荷的急性加重模型。

  • 大鼠品系

Sprague-Dawley (SD)大鼠是Amyloid β-Peptide (1-42)（Aβ1-42，）注射模型中最常用的大鼠品系，脑体积较大，立体定位坐标清晰，海马、皮层等靶区定位准确。

Wistar大鼠是常用的远交系大鼠，特点是攻击性低，适合长期饲养和反复操作，对代谢性疾病（如糖尿病）较敏感，适合研究Aβ与代谢综合征的交互作用。

Lewis大鼠是近交系大鼠，适用于研究Aβ1-42诱导的神经炎症与免疫应答的相互作用。

Long-Evans大鼠是常用的远交系大鼠，适用于Aβ1-42（β淀粉样蛋白，β-Amyloid (1-42)）诱导的AD模型中视觉相关的认知测试及大脑皮层功能研究。

2. 非人灵长类（NHP）动物

恒河猴和食蟹猴等动物是构建非人灵长类AD模型的常用模式生物，可在这两种衰老动物模型上叠加注射Aβ1-42寡聚体或纤维体，以研究Aβ1-42在老年动物模型中的潜在发病机理和干预手段。

3. 斑马鱼（Zebrafish）

斑马鱼也是AD研究中的重要模型，具有繁殖快、成本低、胚胎透明等优势。有研究将24 hpf（hours post fertilization）胚胎去膜后，用微量注射器将5-10 nL的10 μM Aβ1-42注射至后脑室，出现新生斑马鱼认知缺陷（视觉运动反应降低）和tau蛋白磷酸化增加等现象[3]。

三、β-Amyloid (1-42)（Aβ1-42）的给药方式与剂量（以大/小鼠为例）

1. 脑室内注射（Intracerebroventricular, ICV）

ICV注射可使Aβ快速分布至全脑脑室系统，适合建立急性AD模型。

  • 注射坐标（小鼠）：以前囟（bregma）为参考，前后位（AP）= -0.34至-1.0 mm，中外侧（ML）= -1.0至1.8 mm，背腹侧（DV）= -2.4至-3.0 mm

  • 剂量范围（小鼠）：0.25 ~ 4 nmole/只（约1.1 ~ 17.6 μg/只）。常用浓度为400 pmol（约1.76 μg）/只，溶于3 ~ 5 μL 双蒸水

  • 注射坐标（大鼠）：AP = -0.8至-1.0 mm，ML = ±1.4至1.5 mm，DV = -3.5至-4.0 mm

  • 剂量范围（大鼠）：5 ~ 10 μg/只（1 μg/μL，5 ~ 10 μL），或80 μmol/L稀释于5 μL双蒸水

2. 海马立体定位注射（Intrahippocampal）

  • 注射坐标（小鼠）：AP = -2.0至-2.2 mm，ML = ±1.3至1.5 mm，DV = -2.0至-2.2 mm

  • 剂量范围（小鼠）：每侧海马1 ~ 2 μg Aβ寡聚体（20 μM，1 μL），或每侧5 μg纤维状Aβ1 ~ 42（2 μg/μL，2.5 μL）

  • 注射坐标（大鼠）：AP = -3.3至-3.8 mm，ML = ±2.0至2.5 mm，DV = -2.5至-3.0 mm

  • 剂量范围（大鼠）：每侧海马2 ~ 5 μg，溶于2 ~ 4 μL

  • 注射速度：0.2 ~ 2 μL/分钟

  • 术后处理：注射完成后留针5分钟，缓慢拔针，缝合皮肤，保温复苏

四、模型验证与评价

大/小鼠术后1-4周进行以下检测：

  • 行为学：Y迷宫、Morris水迷宫、新物体识别实验评估认知功能

  • 病理学：免疫组化检测Aβ沉积（6E10、4G8抗体）、tau磷酸化、突触标志物

  • 生化分析：Western blot检测APP、BACE1、炎症因子等

  • 神经毒性：TUNEL染色、Fluoro-Jade B染色检测神经元凋亡/退变

范例详解

Basic and Clinical Medicine. 2024 Jul 29;44 (08).

在上述文章中，科研人员在SD大鼠侧脑室中注射了由AbMole提供的Amyloid β-Peptide（Aβ1-42，β淀粉样蛋白，107761-42-2），成功构建了大鼠AD模型，并通过Morris水迷宫等实验检测了大鼠学习和记忆行为能力变化。

参考文献及鸣谢

[1] Stine, W. B.; Jungbauer, L.; Yu, C.; et al. Preparing synthetic Aβ in different aggregation states. In Alzheimer's Disease and Frontotemporal Dementia: Methods and Protocols, Springer, 2010; pp 13-32.

[2] Dahlgren, K. N.; Manelli, A. M.; Stine, W. B., Jr.; et al. Oligomeric and Fibrillar Species of Amyloid-β Peptides Differentially Affect Neuronal Viability *. Journal of Biological Chemistry 2002, 277 (35), 32046-32053.

[3] Nery, L. R.; Eltz, N. S.; Hackman, C.; et al. Brain intraventricular injection of amyloid-β in zebrafish embryo impairs cognition and increases tau phosphorylation, effects reversed by lithium. PloS one 2014, 9 (9), e105862.

[4] Kim, H. Y.; Lee, D. K.; Chung, B. R.; et al. Intracerebroventricular Injection of Amyloid-β Peptides in Normal Mice to Acutely Induce Alzheimer-like Cognitive Deficits. Journal of visualized experiments : JoVE 2016, (109).