2026年6月11日，中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室李会军团队、南京林业大学化学工程学院姜艳团队等，在《Phytomedicine》（JCR Q1，Impact Factor=11.3）在线发表题为“AI-driven discovery of synergistic combinations from Psoralea corylifolia fruit for treating osteoporosis”的研究论文。该文于2026年1月9日投稿，2026年5月21日修回，2026年6月8日接收。
该研究聚焦雌激素缺乏相关骨质疏松，围绕传统中药补骨脂果实（Psoralea corylifolia fruit，PCF）中“哪些成分真正发挥抗骨质疏松作用、哪些成分组合具有协同效应”这一问题，建立了一套AI驱动的分步筛选流程。研究首先通过机器学习模型从PCF化学成分库中筛选具有“雌激素样活性+抗骨质疏松潜力”的候选成分，再结合分子对接、分子动力学、多维药效评价和Chou-Talalay协同分析，最终确定新补骨脂异黄酮（neobavaisoflavone，NBIF）与补骨脂甲素（bavachin，BA）组成的协同组合。该组合在体外成骨/破骨细胞模型、斑马鱼骨质疏松模型和去卵巢大鼠模型中均表现出较好的抗骨质疏松活性，并在90%置信区间评价中与PCF提取物呈现药效等效性。需要注意的是，本研究主要基于细胞、斑马鱼和大鼠实验，不能直接等同于人体临床疗效。
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【摘 要】
背景：雌激素缺乏性骨质疏松需要安全、有效的治疗策略。补骨脂果实（Psoralea corylifolia fruit，PCF）是一种具有植物雌激素特征、用于骨质疏松相关研究的中药资源，但其关键活性成分和协同组合尚未明确，这限制了其进一步应用。
目的：本研究建立了一套AI驱动的分步筛选策略，用于从PCF中识别抗骨质疏松协同组合，定量评价其协同作用，并验证其药效学活性，从而为复杂疾病治疗研究提供参考。
方法：研究提出了AI驱动的分步整合策略：首先，通过双重“雌激素样活性/抗骨质疏松”模型，在人工智能辅助下对PCF活性成分进行初筛；其次，采用分子模拟，包括分子对接和分子动力学，对候选成分进行二次筛选；再次，通过多维评价精准锁定先导成分；最后，采用Chou-Talalay方法判断协同、相加或拮抗作用，其中组合指数（combination index，CI）<0.9定义为协同作用，0.9≤CI≤1.1定义为相加作用，CI>1.1定义为拮抗作用。最终，研究通过系统的体外和体内药效学评价，并结合基于90%置信区间的药效等效性分析，验证所筛选协同组合的药效活性。
结果：机器学习（machine learning，ML）筛选首先识别出20个活性成分，随后经分子模拟缩小至6个候选成分。最终确定3个先导成分：新补骨脂异黄酮（neobavaisoflavone，NBIF）、补骨脂甲素（bavachin，BA）和异补骨脂查耳酮（isobavachalcone，IB）。其中，NBIF+BA组合表现出显著协同作用（CI<0.9），其药效优于单一成分，并与PCF提取物呈现药效等效性，90%置信区间为78.12%—132.15%。
结论：该AI驱动策略成功从PCF中识别出具有较强抗骨质疏松作用的NBIF+BA协同组合，为复杂疾病治疗中的天然产物协同组合发现提供了一种有潜力的研究路径。
01
研究背景及科学问题
骨质疏松、阿尔茨海默病和心血管疾病等慢性复杂疾病具有显著复杂性。化学合成药物通常靶点明确、药效较强，但长期使用常受到不良反应、耐药性和治疗窗较窄等问题限制。协同组合在克服这些局限方面显示出一定价值。为了体现协同组合的重要性，美国食品药品监督管理局（FDA）已经批准了多种用于复杂疾病的复方药物。例如，精神疾病复方药Cobenfy由中枢受体激动剂xanomeline和外周受体拮抗剂trospium chloride组成，可在精准调控中枢神经系统的同时，降低外周不良反应，体现了协同药物设计的优势。
事实上，中药（Chinese herbal medicine，CHM）经过长期经验应用，本身就是复方药物开发和设计的天然范式。然而，中药化学成分复杂，使得活性成分识别和协同组合阐明面临重大挑战，也限制了基于中医药的现代药物开发。
已有许多研究揭示了中药活性成分之间的协同组合。例如，来源于黄芩厚朴汤的活性成分组合HMB由厚朴酚、和厚朴酚和黄芩苷组成，可通过线粒体内源性凋亡通路激活caspase-3并切割GSDME，诱导GSDME依赖性焦亡，从而对转移性结直肠癌发挥协同抗肿瘤作用。该组合还可通过将“冷肿瘤”转变为“热肿瘤”，增强抗PD-1免疫治疗效果。另一个例子是来源于甘草提取物的LQ-LCB组合，由甘草苷和甘草查耳酮B组成，可通过下调造血细胞激酶发挥抗氧化、抗炎和抗纤维化作用，表现出协同抗慢性阻塞性肺疾病（COPD）效应。
不过，当前研究多集中在活性成分的药理作用和机制阐释上，对协同组合的系统筛选框架仍探索不足。具体而言，从中药中发现生物活性组合需要解决三个关键问题：从复杂化学体系中快速筛选潜在活性成分；在候选成分中精准识别协同组合；对优化组合的协同等效性进行定量评价。
中药具有多成分、多靶点整体作用特征，传统筛选方法难以充分捕捉这种整合性治疗效应。在天然产物药物发现中，人工智能（artificial intelligence，AI）有助于精准预测靶点结合、生物活性等关键性质，并可加速虚拟筛选、分子设计和优化过程，从而提高研发效率并降低成本。近年来，机器学习（ML）与计算机辅助药物发现深度融合，显著提升了化合物-活性关系建模的准确性和效率，在药物设计、筛选、合成和再利用中展现出较大潜力。这些进展说明，AI驱动方法可通过结合基于结构和基于靶点的预测策略，高效识别生物活性成分。
另一方面，Chou-Talalay方法能够计算组合指数（CI），为评价药物相互作用是协同还是拮抗提供定量框架。由于该方法简便、成本较低且可靠，已广泛用于癌症和艾滋病等复杂疾病的联合治疗研究。然而，目前大多数研究仍将机器学习筛选和协同评价方法分开使用，尚未建立一个从ML驱动活性成分初筛到定量协同评价相衔接的整合流程。这种方法学割裂限制了从中药中发现协同组合的效率和精准度。
骨质疏松（osteoporosis，OP），尤其是绝经后雌激素缺乏性骨质疏松，其核心特征是骨形成和骨吸收失衡，导致骨密度下降和骨折风险升高。这种复杂性常使单靶点药物在长期管理中面临疗效或安全性限制。在这一背景下，补骨脂果实（PCF）作为传统中医中经典的“补肾”药物，是多靶点治疗干预的重要天然资源。PCF富含具有雌激素样活性的植物雌激素成分，例如黄酮和香豆素类化合物，可通过靶向并结合雌激素受体α/β（ERα/ERβ）来恢复骨代谢平衡。
然而，PCF化学组成复杂，阻碍了其核心活性成分和协同组合的鉴定。传统化合物分离和筛选方法效率较低，也难以充分捕捉多成分之间的协同相互作用。因此，有必要采用更有效的策略，从PCF中探索抗骨质疏松协同成分组合。
为解决上述问题，本研究建立了AI驱动的分步整合策略：AI辅助初筛、基于分子模拟的二次筛选、以药效为导向的精准锁定，以及定量协同研究和验证。研究使用分别针对雌激素样活性和抗骨质疏松药效的数据集训练ML模型，对PCF化学成分库进行筛选，得到20个具有双重生物活性潜力的成分，即可能通过雌激素通路发挥抗骨质疏松作用的成分。随后，根据候选成分与ERα、ERβ的结合亲和力及结构-活性关系，通过分子对接和分子动力学模拟将候选成分缩小至6个。最终，基于多维加权评价，筛选出3个先导成分：NBIF、BA和IB。
基于Chou-Talalay方法的协同分析显示，NBIF-BA组合具有较强协同潜力（CI<0.9）。体外和体内药效学评价进一步证实，该组合不仅显著优于单一成分，也达到了与阳性对照E₂相近的抗骨质疏松效果。值得注意的是，90%置信区间为78.12%—108.60%，提示NBIF+BA组合与PCF提取物之间具有治疗等效性。总体而言，本研究通过建立整合成分筛选、协同定量和药效等效性验证的系统框架，弥补了中药研究中的一个关键方法学缺口。
02
重要发现及亮点
补骨脂提取物的化学成分鉴定及抗骨质疏松活性验证
研究首先采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF-MS）正离子模式，对PCF提取物的化学组成进行分析。通过与对照品比较，共鉴定出13种主要成分。基础峰色谱图显示，这些化合物包括5种香豆素类成分，即补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂定；7种黄酮类成分，即NBIF、BA、corylin、IB、bavachinin、corylifol A和4′-O-methylbavachalcone；以及1种杂萜类成分补骨脂酚（bakuchiol）。这些结果提示，黄酮类和香豆素类是PCF提取物中的主要化学成分。
随后，研究采用CCK-8实验评价PCF对成骨细胞MC3T3-E1增殖和破骨前体细胞RAW264.7活性的影响。结果显示，3.125、6.250和12.500 μg/mL PCF均可显著增强MC3T3-E1细胞增殖，提示其具有促进成骨细胞增殖的作用。同等浓度范围内，PCF对RAW264.7细胞未表现出明显细胞毒性，说明该浓度范围不会直接损害破骨前体细胞存活。
为明确PCF抗骨质疏松作用是否与雌激素信号通路相关，研究使用E₂作为阳性对照，并加入雌激素受体抑制剂ICI 182,780（ICI）进行验证。ALP活性检测和茜素红S染色显示，高浓度PCF提取物（12.500 μg/mL）显著增强成骨细胞ALP活性，并促进钙结节形成；而ICI可明显削弱这一作用，提示PCF可能通过激活雌激素信号通路促进成骨分化。
在破骨细胞分化实验中，RAW264.7细胞被诱导分化为多核破骨细胞。结果显示，PCF提取物处理后TRAP活性呈浓度依赖性下降，而ICI可逆转这种抑制作用，说明PCF对破骨细胞分化的调节同样依赖雌激素信号通路。qRT-PCR结果进一步证实，高浓度PCF组中成骨和破骨功能相关基因表达均与空白对照组存在显著差异。
综合来看，PCF提取物可能通过靶向雌激素信号通路，双向调节成骨细胞和破骨细胞功能平衡，从而发挥抗骨质疏松作用。
图1：PCF提取物的化学成分谱及抗骨质疏松作用。（A）采用UHPLC-QTOF-MS正离子模式获得的PCF基础峰色谱图。（1）补骨脂苷，（2）异补骨脂苷，（3）补骨脂素，（4）异补骨脂素，（5）新补骨脂异黄酮，（6）补骨脂甲素，（7）corylin，（8）补骨脂定，（9）异补骨脂查耳酮，（10）bavachinin，（11）corylifol A，（12）4′-O-methylbavachalcone，（13）补骨脂酚。（B）MC3T3-E1细胞经PCF提取物（3.125—12.500 μg/mL）、E2（10 nM）或溶剂对照处理，并在有或无ICI 182,780（ICI，100 nM）条件下检测ALP活性。（C）显微镜下计数TRAP阳性多核细胞数量。（D）MC3T3-E1细胞中成骨标志物ALP、OCN、Sp7的相对mRNA表达。*P<0.05，与对照组相比；**P<0.01，与对照组相比；***P<0.001，与对照组相比；<0.05，与Control+ICI组相比；#<0.01，与Control+ICI组相比；##<0.001，与Control+ICI组相比。（E）在RANKL（50 ng/mL）刺激下，RAW264.7细胞经PCF提取物、E2或溶剂处理，并在有或无ICI条件下检测破骨标志物TRAP、CTSK、CFOS的相对mRNA表达。（F）成骨细胞组织学染色显示基质矿化。（G）TRAP染色及破骨细胞活性定量分析。显微镜下计数TRAP阳性多核细胞（MNCs，细胞核≥3）。数据以均值±标准差表示（n=6）。*P<0.05，与Control/RANKL组相比；**P<0.01，与Control/RANKL组相比；***P<0.001，与Control/RANKL组相比；##<0.001，与不加ICI的对应组相比。比例尺：100 μm。
机器学习模型初筛具有双重活性潜力的PCF成分
在去重并剔除分子信息不完整的条目后，研究人员从6个数据库和相关文献中共检索到255种PCF相关化学成分。同时，研究还识别出965种与抗骨质疏松活性相关的化合物，其中118种已知通过雌激素依赖性通路发挥作用。通过主成分分析（PCA）进行特征提取后，确认80种成分具有雌激素样活性。此外，研究构建了由1449种既无雌激素样活性、也无抗骨质疏松活性的化合物组成的数据集。
为了筛选PCF提取物中可能通过雌激素通路发挥抗骨质疏松作用的活性成分，研究建立了两类算法框架：随机森林（random forest，RF）模型，以及LSTM/Transformer-CNN-MLP混合模型。每个框架均包含3个子模型：雌激素样活性预测模型、抗骨质疏松活性预测模型，以及集成筛选模型。所有模型均通过准确率、精确率、召回率、F1评分和受试者工作特征曲线下面积（AUC-ROC）进行评价。在集成模型中，只有同时被雌激素样活性模型和抗骨质疏松活性模型预测为阳性的成分，才被判定为具有双重活性的候选成分。
RF模型表现出良好的预测性能。混淆矩阵显示其分类准确率较高，训练集和测试集准确率均超过0.85，AUC-ROC均大于0.90，说明该模型能够较稳健地区分雌激素样活性和抗骨质疏松活性成分。基于两个子模型构建的集成模型进一步识别出排名前10的活性成分。
作为RF方法的补充，研究还构建了LSTM/Transformer-CNN-MLP混合架构。该模型同样显示出较高分类准确率，训练集和测试集准确率随训练逐步升高。在第50轮训练时，两个数据集的准确率均超过0.80，损失值降至0.05以下。基于这些较可靠的预测结果，集成模型同样筛选出排名前10的活性成分。
图2：从PCF提取物中初步筛选雌激素介导抗骨质疏松成分的工作流程。
图3：PCF中雌激素介导抗骨质疏松成分筛选框架的性能评价。（A）随机森林（RF）预测模型的性能评价。（a）模型1的混淆矩阵和ROC曲线。（b）模型2的混淆矩阵和ROC曲线。（B）混合LSTM/Transformer-CNN-MLP模型的性能评价。（a）模型1的混淆矩阵、损失曲线和ROC曲线。（b）模型2的混淆矩阵、损失曲线和ROC曲线。
分子对接和分子动力学二次筛选候选成分
为验证机器学习预测所得双重活性成分的结构-活性关系，研究进一步将20个PCF候选成分与ERα和ERβ的配体结合结构域进行分子对接。结果显示，其中15个成分可在经典配体结合口袋中形成稳定结合构象，并表现出较好的结合亲和力。
结合作者团队此前的PCF定性定量分析、候选成分与ER亚型的对接结合能以及文献中关于骨代谢调节活性的资料，研究最终选择2种香豆素类成分补骨脂素（PSO）、异补骨脂素（IP），以及4种黄酮类成分NBIF、BA、IB和corylin（CL）开展深入协同分析。
这6种成分均以类似E₂的方式占据雌激素受体配体结合口袋，支持其植物雌激素潜力。总体而言，黄酮类成分较香豆素类成分表现出更强且更多样的相互作用。NBIF通过C7位羟基分别与ERα的Glu353和ERβ的Glu305形成氢键，其B环与ERα的Trp383和ERβ的Trp345发生堆叠作用，C-3′异戊烯基深入疏水亚口袋，为其ERβ偏向性活性奠定基础。IB可通过C2位羟基与ERα的His524形成水介导氢键，并与ERβ的Glu305和Arg346形成直接作用。BA在ERβ中形成三重氢键网络，并在ERα中与Glu353和Pro424形成氢键，其异戊烯基可在两种亚型中深入锚定。CL主要依赖极性相互作用，其C6异戊烯基朝向溶剂，未参与疏水核心作用，因此亲和力相对中等。香豆素类成分结合较弱，PSO在ERα中缺乏氢键但可与Phe404形成堆叠作用，在ERβ中则可与Arg346形成盐桥，提示其可能偏向ERβ。IP通过双重氢键和堆叠作用与ERα结合较强，并可与ERβ中的Arg346和Lys401相互作用。
这些结果共同勾勒出PCF植物雌激素活性的结构-活性关系：高亲和力ER结合需要三个关键特征，即C7和/或C4′羟基可与保守氨基酸形成氢键；平面共轭体系可与受体芳香族残基发生π–π堆叠；异戊烯基需要处于合适位置并深入疏水亚口袋，而朝向溶剂的C6异戊烯基对结合亲和力贡献有限。
为进一步验证6个优先成分与ER结合的稳定性和机制，研究进行了100 ns分子动力学模拟。所有配体-ERα/ERβ复合物均可快速达到平衡，并在模拟过程中保持较好的构象稳定性。骨架均方根偏差稳定在0.3 nm以下，配体结合口袋残基的均方根波动较小，提示配体结合后局部运动受到限制。溶剂可及表面积也保持稳定，说明复合物未发生明显结构重排或展开。此外，各复合物平均维持2—3个持续性氢键，进一步支持极性接触的时间稳定性。
基于MM/PBSA方法计算的结合自由能显示，NBIF和IB对两种ER亚型均具有最强亲和力。NBIF与ERα和ERβ的结合自由能分别为−34.220 kcal/mol和−25.617 kcal/mol；IB分别为−37.161 kcal/mol和−32.143 kcal/mol。BA对ERα表现出较高亲和力（−27.620 kcal/mol），但与ERβ结合较弱（−17.100 kcal/mol）。CL偏向ERα，PSO显示中等ERα偏向性，IP与两种亚型均表现出较弱但相近的亲和力。总体而言，分子动力学结果验证了预测结合模式的可靠性。
图4：PCF提取物中6个候选成分与雌激素受体ERα和ERβ的分子对接及结合模式分析。
6个候选成分的体外抗骨质疏松活性
为考察6个候选成分的抗骨质疏松活性，研究在MC3T3-E1成骨前体细胞和RAW264.7破骨前体细胞中分别开展成骨分化和破骨分化实验。为验证雌激素受体通路参与其中，实验设置了ER拮抗剂ICI（0.1 μM）共处理组。细胞毒性实验显示，这些成分在10 μM以下无显著毒性，因此研究选择0.1、1和10 μM三个浓度进行评价，并以0.1 μM E₂作为阳性对照。
在MC3T3-E1细胞中，E₂显著提高ALP活性。6个候选成分在0.1—10 μM范围内均显著增强ALP活性。茜素红染色显示，培养21天后，矿化结节形成能力明显增强，与ALP活性变化趋势一致。qRT-PCR结果进一步表明，这些成分类似E₂，可浓度依赖性上调成骨标志基因ALP、OCN和Sp7的表达。值得注意的是，ICI共孵育可完全阻断这些成分和E₂的促成骨作用，提示其作用依赖ER通路。
在RAW264.7细胞中，E₂和6个候选成分均显著减少TRAP阳性多核细胞数量，并抑制RANKL诱导的破骨分化，同时下调TRAP、CTSK和c-FOS等关键破骨相关基因表达。ICI共处理可消除这些成分的抗破骨作用以及E₂的抑制效应，进一步确认ER通路参与其中。
这些结果表明，6个候选成分均具有促进成骨和抑制破骨的双重活性，并且这些作用在ICI共孵育后被完全阻断，提示其对骨代谢的双向调节可能由ER介导。
图5：6个候选成分对MC3T3-E1细胞的促成骨作用。（A）ALP活性检测反映成骨分化潜力。（B）成骨标志物ALP、OCN、Sp7的相对mRNA表达。（C）成骨细胞组织学染色显示基质矿化。数据以均值±标准差表示（n=6）；*P<0.05，与对照组相比；**P<0.01，与对照组相比；***P<0.001，与对照组相比；##<0.001，与不加ICI的对应组相比。比例尺：100 μm。
图6：6个候选成分对RANKL诱导破骨细胞分化的抑制作用。（A）破骨标志物TRAP、CTSK、CFOS的相对mRNA表达。（B）TRAP染色及破骨细胞活性定量分析。显微镜下计数TRAP阳性多核细胞（MNCs，细胞核≥3）。数据以均值±标准差表示（n=6）；*P<0.05，与RANKL组相比；**P<0.01，与RANKL组相比；***P<0.001，与RANKL组相比；##<0.001，与不加ICI的对应组相比。比例尺：100 μm。
多维加权评价锁定NBIF、IB和BA三个先导成分
研究进一步采用以核心药理活性为导向的多维加权评分系统，对抗骨质疏松核心药效成分进行精准筛选。评分维度包括成骨相关ALP活性、抗破骨相关TRAP活性、分子对接得分以及ADMET性质。
结果显示，NBIF、IB和BA综合表现最为突出。NBIF总体评分最高，为0.81，在核心药效指标上表现优异，其ALP活性评分为0.85，TRAP活性评分高达0.92，同时具有较强靶点结合能力，分子对接评分为0.89。IB总体评分为0.69，位列第二，不仅药理活性较强，在分子对接和ADMET性质方面也具有优势。BA总体评分为0.52，位列第三，在成骨分化相关指标上表现明显，ALP活性评分为0.75。
其余成分CL、PSO和IP总体评分分别为0.39、0.24和0.21。虽然它们在某些单一维度中具有一定活性，但整体表现不及上述3个先导成分。因此，研究最终将NBIF、IB和BA确定为先导成分，并继续开展其协同治疗效应研究。
先导成分组合的协同效应定量研究
为系统研究NBIF、BA和IB不同组合对骨代谢的协同调控作用，研究采用四参数Logistic（4PL）模型分析其对成骨ALP活性和破骨TRAP活性的剂量-效应关系，并使用CI值定量评价组合间相互作用。
3种黄酮组合对ALP和TRAP活性的剂量-反应关系及协同效应显示，IB和BA在0.1 μM时对ALP活性和TRAP抑制表现出最大效应，而NBIF在1 μM时达到峰值药效。
NBIF+IB组合在0.1 μM+0.1 μM时表现出较强ALP协同作用（CI<0.7），并在中等浓度范围内显示中度TRAP协同作用（CI<0.9）。NBIF+BA组合则呈现独特的浓度依赖性ALP协同增强，在1 μM+1 μM时达到最大效应（CI<0.6）；其最强TRAP协同作用出现在0.1 μM+0.1 μM时（CI<0.7）。相比之下，BA+IB组合仅在中等浓度下表现出有限ALP协同作用（CI<0.9），但在几乎所有测试比例下对TRAP均呈现一定协同抑制作用（CI<0.9）。
总体而言，三种组合均显示出协同效应，为后续研究提供了基础依据。
图7：采用Chou-Talalay方法分析3个先导成分组合对ALP/TRAP活性的剂量-反应曲线和协同热图。（A）NBIF+IB组合。（B）NBIF+BA组合。（C）BA+IB组合。
NBIF+BA协同组合在体外表现出更优的双向骨代谢调节作用
为了进一步评价先导成分组合对骨代谢的体外作用，研究检测了其对成骨分化和破骨形成的影响。所有处理组，包括单一成分NBIF、BA、IB及其组合，均较对照组增强了成骨活性，表现为ALP活性升高、成骨标志基因mRNA表达上调，以及茜素红S染色显示的矿化结节形成增强。
在所有组合中，NBIF+BA表现出最佳效果，提示其可能是促进成骨分化的有效协同组合。
在破骨形成方面，细胞计数和TRAP染色结果显示，所有处理组TRAP阳性破骨细胞数量均显著低于RANKL组。同时，破骨相关基因TRAP、CTSK和cFOS的mRNA表达在所有处理组中均下调，说明这些成分或组合在细胞和分子水平上均具有抑制破骨作用。
此外，各药物组合对破骨形成的抑制作用均强于对应单一成分。其中，NBIF+BA抑制作用最为突出，提示该组合对破骨细胞形成和功能具有更强调节作用。综合这些结果，NBIF+BA协同组合有望作为用于骨质疏松研究的双重作用先导成分组合。
图8：先导成分及其组合的抗骨质疏松作用。（A）ALP活性检测反映成骨分化潜力。（B）显微镜下计数TRAP阳性多核细胞数量。（C）MC3T3-E1细胞中成骨标志物ALP、OCN、Sp7的相对mRNA表达。（D）RAW264.7细胞中破骨标志物TRAP、CTSK、CFOS的相对mRNA表达。（E）成骨细胞组织学染色显示基质矿化。（F）TRAP染色及破骨细胞活性定量分析。显微镜下计数TRAP阳性多核细胞（MNCs，细胞核≥3）。数据以均值±标准差表示（n=6）。*P<0.05，与RANKL组相比；**P<0.01，与RANKL组相比；***P<0.001，与RANKL组相比；##<0.001，与不加ICI的对应组相比。比例尺：100 μm。
NBIF+BA在斑马鱼骨质疏松模型中改善骨矿化并调节ALP/TRAP活性
骨矿化是评价骨形成的特异且敏感指标。由于斑马鱼幼鱼透明，可通过茜素红染色观察骨组织。研究通过分析头骨茜素红染色面积和积分光密度（IOD）评估骨矿化水平。
在斑马鱼幼鱼模型中，Dex组头骨茜素红染色面积和密度均显著低于对照组，提示骨质疏松模型建立成功。E₂、PCF以及各给药组均可逆转Dex诱导的骨矿化下降。其中，NBIF+BA高剂量组对骨矿化面积和密度的恢复作用最明显。与此同时，研究检测了幼鱼匀浆中的ALP和TRAP活性。NBIF+BA高剂量组显著增强ALP活性，并明显抑制TRAP活性，其作用与阳性对照E₂和PCF相当，并显著优于NBIF高剂量单体组。
研究进一步采用Dex诱导的成年斑马鱼骨质疏松模型评价协同组合对骨吸收的影响。Dex暴露10天后建立模型，第11天将模型斑马鱼随机分入不同处理组，收集鱼鳞和血清样本，进行ALP染色、TRAP染色及酶活性检测。
与对照组相比，Dex诱导组鱼鳞ALP阳性染色面积显著下降，TRAP阳性染色面积显著升高，证实骨质疏松模型建立成功。在成骨功能方面，所有处理组均可逆转Dex诱导的ALP表达抑制，表现为鱼鳞ALP阳性面积显著扩大。NBIF+BA高剂量组效果最明显，其ALP阳性表达不仅显著高于NBIF高剂量单体组，也与E₂和PCF组相近，这一结果与血清ALP酶活变化一致。
在破骨功能方面，所有处理组均有效抑制TRAP表达，鱼鳞TRAP阳性染色面积较Dex组显著下降。NBIF+BA高剂量组的抑制效果与E₂和PCF组相似，并显著强于NBIF高剂量单体组。这一趋势同样与血清TRAP酶活变化一致。
这些结果表明，NBIF+BA组合可通过双向调节恢复骨代谢平衡，其药效超过单一成分，并与E₂和PCF相当，从而验证其在骨代谢调节中的协同作用。
图9：协同组合在斑马鱼中的抗骨质疏松作用。（A）糖尿病性骨质疏松斑马鱼幼鱼的茜素红S染色。（B-C）幼鱼头骨矿化面积和矿化密度的统计分析（n=10）。（D）斑马鱼幼鱼ALP活性。（E）斑马鱼幼鱼TRAP活性。（F）成年斑马鱼TRAP染色代表性图像。（G）成年斑马鱼鱼鳞中TRAP阳性面积的统计分析。（H）成年斑马鱼ALP染色代表性图像。（I）成年斑马鱼鱼鳞中ALP阳性面积的统计分析。（J）成年斑马鱼ALP活性。（K）成年斑马鱼TRAP活性。##<0.001，与对照组相比；*P<0.05，与Dex组相比；**P<0.01，与Dex组相比；***P<0.001，与Dex组相比；&&&P<0.001，与NBIF-H组相比。比例尺=500 μm。
NBIF+BA在去卵巢大鼠模型中改善骨微结构并恢复骨转换平衡
研究进一步在去卵巢（ovariectomized，OVX）SD大鼠模型中评价NBIF+BA协同组合的体内抗骨质疏松作用。双侧去卵巢导致模型组体重明显增加，而药物干预可对这一变化产生显著调节。与假手术组相比，OVX手术显著降低子宫指数，说明雌激素缺乏模型建立成功。所有给药组均改善子宫指数，其中NBIF+BA高剂量组效果最明显，并显著优于NBIF高剂量单药组。
Micro-CT成像和定量分析显示，OVX导致大鼠严重骨小梁丢失和骨微结构损伤，表现为骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）显著下降，同时骨小梁分离度（Tb.Sp）明显升高。各给药组均可显著改善骨小梁微结构，表现为BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th升高，Tb.Sp下降。
HE染色显示，假手术组骨小梁结构致密完整，而OVX组出现明显骨小梁断裂、小梁间隙增宽以及骨髓腔内大量脂肪细胞浸润。所有干预方案均能改善这些结构损伤，其中NBIF+BA高剂量组恢复效果最佳，表现为骨小梁连接良好、结构较完整，骨小梁破坏、骨丢失和骨髓脂肪变明显减轻。
TRAP染色显示，OVX显著增加破骨细胞数量和活性，红色染色面积增强，提示骨吸收升高。药物干预能够逆转这些病理改变，其中NBIF+BA高剂量组改善最为明显。
血清骨转换标志物进一步反映了骨代谢动态变化。与假手术组相比，OVX组骨吸收标志物BALP和CTX-I显著升高，骨形成标志物PINP明显下降。与OVX组相比，所有给药组均显著降低BALP和CTX-I水平，升高PINP水平，从而恢复骨转换平衡。其中，NBIF+BA高剂量组作用最强。
总体来看，BA和NBIF具有协同增强骨量和改善骨微结构的作用。该组合可改善骨小梁微结构、恢复骨转换稳态并抑制过度破骨活性，从而有效预防OVX诱导的骨丢失。
图10：协同组合在OVX大鼠中的抗骨质疏松作用。（A）骨小梁Micro-CT重建图。（B）大鼠体重变化。（C）子宫指数，即子宫重量/体重。（D-H）各组BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp比较。（I）大鼠股骨HE染色图像。（J）TRAP染色代表性图像。（K-M）血清BALP、PINP、CTX-Ⅰ水平。数据以均值±标准差表示（n=8）。##<0.001，与Sham组相比；*P<0.05，与OVX组相比；**P<0.01，与OVX组相比；***P<0.001，与OVX组相比；&P<0.05，与NBIF-H组相比；&&P<0.01，与NBIF-H组相比；&&&P<0.001，与NBIF-H组相比。比例尺=100 μm。
NBIF+BA组合与PCF提取物具有药效等效性
为确认NBIF+BA协同组合是否能够再现PCF粗提物的抗骨质疏松药效，研究对所有药效终点进行了90%置信区间分析。
在斑马鱼幼鱼模型中，该组合相对于PCF提取物的相对药效90%置信区间范围为78.12%—108.60%；在成年斑马鱼模型中，范围为88.74%—108.02%；在OVX大鼠模型中，范围为78.31%—132.15%。
所有90%置信区间均完全落入预设等效范围70.0%—143.0%内，符合药效代表性标准。这些结果表明，NBIF+BA组合在幼年和成年骨质疏松模型中均与PCF粗提物表现出一致的抗骨质疏松药效。该发现验证了所识别的协同组合可作为PCF粗提物的药理学等效替代组合。
【贡献】★★★★★
本研究建立了一套用于从中药中发现协同组合的AI驱动整合流程：AI驱动初筛、基于分子模拟的二次筛选、以药效为导向的精准锁定，以及定量协同验证。该方法围绕疾病相关通路进行候选成分筛选和验证，有助于解决中药研究中“活性成分不清晰”等核心瓶颈。
基于这一流程，研究从PCF中识别出NBIF+BA组合，并证明其具有较强抗骨质疏松作用。该组合通过双向调节成骨细胞和破骨细胞功能发挥协同效应。体外和体内研究证实，NBIF+BA的药效优于单一成分，与阳性对照药物作用相近，并在药效学上与PCF粗提物等效。
总体而言，本研究为雌激素缺乏性骨质疏松提供了一种新的天然产物协同组合研究思路，也提供了一个可扩展的协同天然产物组合发现框架。该流程未来可进一步应用于其他中药研究，加速中医药理论向现代循证医学证据转化，并为药物开发提供新的路径。
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