Adv Sci | 佘群新/冯旭团队开发多同源臂CRISPR基因组修剪策略CREAT，实现微生物基因组高效精简|crispr|佘群新|古菌|同源|微生物|生物学

构建最小基因组微生物，既是探索生命核心代谢途径、解答“维持生命所需最小基因集合”基础命题的理想模型，也是合成生物学中打造高效工业生物制造底盘的关键路径。目前主流的“自上而下”基因组缩减策略，受限于必需基因注释不全、合成致死效应与功能冗余基因广泛存在等问题，大片段基因组删除往往反复失败，只能通过逐段试错、多轮迭代的方式缓慢推进，效率与深度均面临长期瓶颈。

近日，山东大学微生物技术国家重点实验室CRISPR与古菌生物学研究中心佘群新教授、冯旭研究员团队在Advanced Science在线发表题为CREAT: A CRISPR-Based Genome Trimming Strategy for Systematic Identification of Dispensable Regions and Rapid Genome Reduction的研究论文。团队创新性提出名为CREAT的多同源臂模板CRISPR基因组修剪策略，将CRISPR靶向基因组切割与“同源臂步移”技术创新融合，建立“必需区分类-合成式替换”的两步式工作流，在古菌模式生物中实现20.8%的基因组缩减，并成功拓展至多种细菌，为系统性、高效构建微生物最小基因组提供了通用新工具。

为解决传统删除方法“试错成本高、分区效率低”的核心痛点，研究团队受真核生物VDJ重组产生抗体多样性的机制启发，开发了同源臂步移（Homology arms walking, HA walking）技术。该技术通过设计串联排列的多同源臂作为修复模板，在CRISPR靶向切割产生DNA双链断裂后，靶向位点两侧的不同组合的同源臂与基因组发生随机同源重组，可在单次实验中产生覆盖所有缺失组合的突变体库，从而系统划分目标区段内的非必需区、必需区与准必需区。这一方法将多轮功能验证整合为一步化的多重分析，不仅大幅提升了分区效率，还能同步筛选出生长优势更优的突变株，为获得性能优良的精简基因组菌株提供了天然便利。

随后基于同源臂步移获得的精确必需基因信息，研究团队建立了完整的CREAT基因组精简核心流程：将鉴定得到的必需/准必需基因组装为人工合成的同源臂模块，通过一步基因组替换，将原本分散在必需区之间的非连续非必需序列一次性精准删除，直接获得深度修剪的基因组突变株。系统实验验证表明，CREAT策略同时适用于古菌与细菌，兼容内源I型CRISPR、外源Cas9等多种编辑系统，具备良好的普适性与多轮迭代能力。