当两个融合信号看起来几乎完全相同时，我们该如何判断，谁才是真正的“美猴王”？
图 1：当两个融合信号看起来几乎完全相同时， 我们该如何判断， 谁才是真正的‘美猴王’ ？
如果一种 RNA 信号在测序数据中反复出现，
如果它能被 PCR 扩增出来，
如果它看起来像是由两个基因拼接而成，
我们是否就可以说：
这个融合转录本，真实存在？
在过去很多年里，融合转录本一直是转录组研究中一个充满吸引力的话题。
它们最早在癌症研究中受到广泛关注。某些由基因组重排形成的融合基因，确实能够产生功能明确的融合转录本，并驱动疾病发生。随着高通量测序技术的发展，越来越多的融合转录本也开始在植物中被报道出来。
这似乎打开了一个令人兴奋的新世界：
植物中是否也广泛存在融合转录本？
它们是否参与发育、逆境响应、杂种优势甚至作物改良？
它们是否代表着一种被忽视的转录组调控层次？
我们最初也带着类似的问题进入这项研究。
但随着分析一步步推进，一个更基础、更尖锐的问题浮现出来：
我们检测到的融合信号，真的等于植物体内发生了融合吗？
一、一个看似真实的信号
融合转录本，简单来说，是一个转录本中同时包含来自两个不同基因的序列。
从概念上看，它可能来自两个层面。
第一类是 DNA 层面的融合。例如基因组中发生缺失、倒位、易位或重复等结构变异，使两个原本分开的基因在 DNA 层面被物理连接，形成融合基因，进而产生融合转录本。
第二类是 RNA 层面的融合。这类融合不涉及基因组结构改变。两个基因在 DNA 上仍然是分开的，但它们的 RNA 产物可能在转录或转录后阶段被连接在一起。
从生物学想象力来看，RNA 层面的融合尤其迷人。
因为它似乎意味着，在不改变基因组的情况下，植物也可能通过 RNA 层面的重组，产生新的转录本结构。
然而，正是这种“看起来很合理”的信号，最容易让我们忽略一个问题：
检测方法本身，也可能制造出看似合理的融合。
二、真假美猴王：两个几乎一样的融合转录本
我们借用了《西游记》中“真假美猴王”的意象。真假美猴王最令人印象深刻的地方在于：他们长得几乎一样，声音一样，本领一样，连身边的人也难以分辨。
植物融合转录本的真假问题，也有类似的困境。
一个真实融合转录本和一个假阳性融合信号，在测序数据中可能看起来非常相似：
它们都可能有跨基因的 reads；
它们都可能有看似明确的融合断点；
它们都可能被 PCR 扩增；
它们甚至可能在多个样本中被重复检测到。
问题是：
这些证据是否足以证明它真实存在？
在“真假美猴王”的故事里，连火眼金睛和寻常法器等都无法轻易分辨孰真孰假。植物融合转录本的识别也面临类似困境。在这项研究中，我们重新塑造了一面“科学照妖镜”，它不是某一种单独技术，而是由多种方法共同构成的验证体系：
长读长 RNA 测序，尤其是Nanopore direct RNA sequencing；
融合断点精细分类；
体内外亲本基因混样对照；
基因型匹配的参考基因组；
高质量基因模型注释；
我们的目标不是简单地说“哪些融合是真的，哪些是假的”，而是想回答一个更重要的问题：
当我们检测到一个融合转录本时，如何判断它是否真的发生了？
三、长读长测序，给了我们重新审视的机会
短读长 RNA-seq 曾极大推动融合转录本研究的发展，但它也有天然局限。
reads 太短，难以完整覆盖融合结构。许多判断依赖局部拼接、split reads 或 chimeric alignments。一个看似跨基因的信号，可能只是复杂转录本结构中的一个局部片段。
长读长 RNA 测序的出现，让我们第一次有机会从更完整的转录本结构上重新审视这些信号。
在这项研究中，我们整合了多种 RNA 测序平台：
- PacBio Iso-Seq：提供较长、较完整的转录本读段；
- Nanopore PCR-cDNA sequencing：能够捕获大量长读长转录本，但仍包含反转录和 PCR 扩增过程；
- Nanopore direct RNA sequencing：不经过反转录和 PCR，能够直接读取天然 RNA 分子，是判断技术假象的重要参照；
- 短读长 RNA-seq：帮助我们与传统检测体系进行比较。
这些技术不是简单叠加，而是相互制衡和补充。
如果一个融合信号只在 PCR 相关平台中大量出现，却在 direct RNA 中缺失，我们就必须警惕：
它可能不是生物学事件，而是检测过程中的产物。
四、隐藏在断点处的线索：SHS 与模板链切换
在大量候选融合转录本中，我们发现一个非常关键的特征：
许多融合断点附近存在短同源序列，也就是 short homologous sequences，简称 SHS。
这些短短几个碱基的同源序列，看起来不起眼，却可能成为假阳性融合信号产生的关键。
在反转录过程中，反转录酶可能从一个 RNA 模板跳到另一个具有短同源序列的模板上，形成一条人工拼接的 cDNA。这个过程称为模板切换。
换句话说，两个原本独立的 RNA 分子，并没有在细胞里真正融合；但在实验过程中，它们可能被“错误地缝合”在一起。
这就像真假美猴王中的“假猴王”：
外表几乎一样，甚至能通过很多表面检测；
但它的来源并不是真实的生物学事件，而是检测过程中的假象。
图 2：SHS 介导的模板切换示意图
五、体外与体内实验：检测到，不等于发生了
为了验证 SHS 介导的假阳性融合，我们设计了体外和体内两类实验。
体外实验相对直观。
我们将两个 partner 基因的模板按照等比例混合，并设置了保留 SHS 和去除 SHS 的对照。结果显示，当 SHS 存在时，可以检测到融合信号；而去除 SHS 后，融合信号消失。
进一步使用不同反转录酶后，我们发现，某些反转录条件更容易产生这种融合信号。
这说明：
融合信号可以在体外由技术过程产生。
但这还不够。
因为有人可能会问：体外混样是一种相对极端的条件，在真实细胞环境中也会发生类似情况吗？
于是，我们进一步设计了体内原生质体实验。
这个实验最重要的逻辑是：通过标签和特异性引物区分外源导入的 partner 转录本和内源基因表达，从而构建一个理论上不应发生真实融合的细胞体系。
结果显示，即便在这样的体系中，仍然可以检测到融合信号。
这一点非常关键。
它并不是想证明“细胞里永远不存在真实融合”，而是在说明：
融合检测信号可以独立于真实融合事件而产生。
也就是说：
检测到融合，不等于发生了融合。
这句话，是我们整项研究最核心的概念。
图 3：混样体外/体内实验验证
六、植物基因组，让问题更加复杂
为什么植物中特别需要重新审视融合转录本？
因为植物基因组本身非常复杂。
许多植物经历过多倍化；转座元件含量高；结构变异丰富；不同品种之间存在大量基因组差异；参考基因组和注释版本也可能不一致。
在这样的背景下，融合信号的来源会变得更加复杂。
例如，当 RNA-seq reads 被比对到一个并不完全匹配的参考基因组上时，原本正常的转录本可能被误判为跨基因融合。
当两个注释版本对同一区域的基因边界定义不同，一个“融合转录本”可能只是注释差异造成的假象。
当基因组组装存在局部错误，检测工具也可能把本不存在的跨基因结构识别为融合。
因此，在植物中研究融合转录本，不能只问：
“检测到了多少个？”
更应该问：
“这些检测信号有多少真正可信？”
七、从“发现更多”到“验证更准”
高通量测序时代，我们习惯于被数据量震撼。
更多 reads，更多候选事件，更多新奇结构，更多潜在功能。
但数据量越大，越需要更严格的判断标准。
因为高通量技术不仅放大真实信号，也会放大假象。
如果缺少严格验证，漂亮的信号可能变成误导性的故事；大量候选事件可能堆积成膨胀的 catalog；后续实验则可能投入大量时间和经费去验证本不存在的生物学事件。
因此，我们认为，植物融合转录本研究需要从“发现驱动”进一步走向“可靠性驱动”。
这并不是削弱这个领域的重要性，恰恰相反。
只有先建立可靠的判断标准，真正的融合转录本才更有可能被准确识别出来。
八、给植物融合转录本研究的一面“科学照妖镜”
如果说“真假美猴王”的故事需要如来佛祖，那么植物融合转录本研究需要的是一套可重复、可审查、可验证的判断框架。
在这项研究中，我们希望推动的不是“少发现”，而是“更准确地发现”。
对于一个候选融合转录本，至少需要从以下几个层面重新审视：
- 优先使用 direct RNA 证据：尽量减少反转录和 PCR 过程带来的技术假象；
- 精细分析融合断点：特别关注断点附近是否存在 SHS 等容易诱发模板切换的序列特征；
- 使用匹配的参考基因组：降低基因型差异、结构变异和组装偏差造成的错误比对；
- 修正和比较注释版本：避免把注释边界差异误判为跨基因融合；
- 设计严格的体内外混样和阴性对照：判断信号是否可以在没有真实融合的条件下产生；
这套框架并不是为了否定植物融合转录本研究。相反，它是为了帮助我们把真正值得相信的信号从复杂数据中识别出来。
图 4：研究的图文摘要。
九、我们真正想传递的信息
如果用一句话概括这项研究，我们想说的是：
What we detect is not always what exists.
或者用中文说：
检测到的，不一定就是真实存在的。
这句话不只适用于融合转录本，也适用于很多高通量组学研究。
RNA editing、RNA modification、alternative splicing、circRNAs、lncRNA translation、TE-derived transcripts……
在这些领域中，我们都可能遇到同样的问题：
一个信号很漂亮，
一个结果很诱人，
一个故事很完整，
但它是否真实存在，仍需要更严格的证据链。
因此，这项研究并不是为了终结植物融合转录本研究，而是希望为它提供一套更可靠的“火眼金睛”。
它提醒我们：
在长读长 RNA 测序时代，技术让我们看得更远，也要求我们看得更准。
真正重要的，不只是发现更多信号，而是知道哪些信号值得相信。
结语：从真假美猴王到真假融合转录本
《西游记》中，真假美猴王之所以成为经典，是因为它讲的不只是两个形象之间的对抗，而是一个更深层的问题：
当真假如此相似，我们该如何识别真相？
植物融合转录本研究也面临类似的问题。
测序信号可以很强，断点可以很清楚，PCR 条带可以很漂亮。
但这些并不天然等同于真实生物学事件。
我们需要更严谨的工具、更清晰的概念、更可靠的验证框架。
这就是这项研究想要提供的东西。
从某种意义上说，我们并不是在寻找更多“融合转录本”，而是在寻找一种更可靠的方式，去判断：
哪些才是真正值得相信的生物学信号。
这项研究由广西大学与华中农业大学等单位联合完成。广西大学生命科学与技术学院朱玺桐、华中农业大学卢馨妍、张增鑫，以及广西大学生科院硕士生唐倩为论文共同第一作者；华中农业大学欧阳亦聃教授和广西大学/崖州湾实验室陈玲玲教授为论文共同通讯作者。本研究得到了国家自然科学基金等项目的支持。
论文题为The hidden sources of spurious fusion transcripts in plants，2026年7月26日在线发表于Genome Biology杂志。
论文链接为：
https://link.springer.com/article/10.1186/s13059-026-04179-8
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