Nature | mRNA疗法的新修饰策略：N4-乙酰胞苷兼顾高表达和高保真性|mrna|乙酰胞苷|原性|核糖体|细胞|翻译|蛋白

撰文 |Sure

S ynthetic messenger RNA（合成信使核糖核酸，synthetic mRNA）已经成为重要治疗平台，可以用于疫苗、肿瘤免疫治疗、蛋白替代治疗和基因编辑工具表达。典型的 synthetic mRNA需要经过 5′ cap和 poly(A) tail修饰，并通过脂质纳米颗粒（ LNP）递送进入细胞【 1】。与内源性mRNA不同，外源递送的synthetic mRNA通常经由内体途径进入细胞，容易激活先天免疫识别，诱导type I干扰素反应和真核起始因子2α磷酸化，进而导致RNA降解和全局翻译抑制。因此，如何同时提高稳定性、降低免疫刺激、增加蛋白产量，是synthetic mRNA治疗设计中的核心问题。目前工业界最常用的修饰核苷是 N1-methylpseudouridine（N1-甲基假尿苷，m 1 Ψ）【 2】。它通常替代尿苷（ U）掺入体外转录信使核糖核酸（ IVT mRNA）中，可以降低先天免疫激活，提高mRNA稳定性和蛋白表达。因此， m 1 Ψ已经成为很多synthetic mRNA产品的标准修饰。然而，近年研究提示m 1 Ψ可能降低翻译保真度，导致提前终止和核糖体移码，从而产生非预期蛋白片段或新抗原【 3-5】。因此，m1Ψ虽然有效，但并非一定是最优修饰，需要寻找能够同时维持低免疫原性、高蛋白产量和高翻译准确性的替代策略。

近日，来自美国国家癌症研究所的 Shalini Oberdoerffer 与约翰斯·霍普金斯大学医学院的 Bin Wu 合作在 Nature 上发表了研究论文 N 4 -Acetylcytidine enhances synthetic mRNA translation yield and fidelity 。该研究提出修饰核糖核苷酸对synthetic mRNA的影响不能只看RNA稳定性和免疫原性，还必须考虑翻译延伸速率。未修饰mRNA延伸较快，但容易激活免疫反应并抑制翻译起始。m 1 Ψ可以降低免疫刺激，但会过度减慢延伸，导致核糖体碰撞、质控介入和移码风险。作者发现 ac 4 C 则在降低免疫刺激的同时，使翻译延伸保持在更有利于蛋白产量和翻译准确性的范围内。因此，他们将ac 4 C定义为一种有潜力替代或补充m 1 Ψ的synthetic mRNA修饰。

作者关注的候选修饰是N4-acetylcytidine（N4-乙酰胞苷，ac4C）， ac 4 C是一种天然存在的 RNA 修饰。此前该团队已经发现，ac 4 C可以增强 HeLa细胞中IVT mRNA的翻译。机制上，ac 4 C可以稳定胞苷和鸟苷的碱基配对，增强同源转运核糖核酸（ cognate tRNA）与mRNA的解码匹配，从而促进编码序列中的翻译延伸。但 ac 4 C如果位于 5′非翻译区，可能形成 RNA 二级结构并抑制核糖体扫描，从而抑制翻译起始。因此，在本文中作者特意设计了无胞苷 5′ 非翻译区，使 ac 4 C主要限制在编码序列中。作者首先构建了编码纳米荧光素酶的IVT mRNA，分别掺入 ac 4 C、m 1 Ψ、pseudouridine（假尿苷，Ψ）和 5-methylcytidine（5-甲基胞苷，m 5 C），并与未修饰 mRNA 比较。结果发现，在多种细胞中， ac 4 C 修饰的mRNA均产生更高蛋白表达。同时， ac 4 C和m 1 Ψ都能显著降低干扰素 β1、肿瘤坏死因子和磷酸化真核起始因子 2α等免疫激活指标。为了证明这一优势不是残余免疫激活差异造成的，作者抑制蛋白激酶PKR，使用减少dsRNA副产物的突变型 T7 RNA 聚合酶，并降低mRNA剂量至不诱导干扰素 β1的范围。所有条件下，ac 4 C仍然保持更高蛋白表达。作者还发现ac 4 C 修饰的m RNA和m 1 Ψ 修饰的 mRNA对核糖核酸酶 T2切割具有类似抵抗力，说明二者抑制内体 Toll 样受体 7/8相关免疫识别的机制可能相似，但蛋白产量差异来自翻译过程本身。此外，作者还排除了LNP递送效率、RNA稳定性差异导致蛋白产量升高的可能性。这些结果表明，ac4C可以在多种细胞和体内环境中提高IVT mRNA的蛋白产量，并且能像m1Ψ一样抑制先天免疫反应。

接下来，作者继续研究 ac 4 C的高蛋白产量究竟来自更多核糖体装载，还是来自更合适的翻译延伸动力学？作者通过新生肽单分子成像（SINAPs）直接观察单条mRNA的翻译状态。结果显示，ac 4 C 修饰的 mRNA 和m 1 Ψ 修饰的 mRNA都比未修饰mRNA 更容易被翻译，并且具有更高核糖体占据。但这并不能解释为什么ac 4 C蛋白产量更高，因为m 1 Ψ的核糖体占据甚至更高。于是作者进一步使用核糖体脱落实验测量翻译延伸速率。结果发现，未修饰的 mRNA延伸最快， ac 4 C 修饰使翻译延伸适度减慢， m 1 Ψ则显著减慢翻译延伸，延伸时间接近ac 4 C的两倍。随后作者检测ZNF598，这是一种识别碰撞核糖体并启动核糖体相关质量控制的 E3泛素连接酶。有趣的是，m 1 Ψ 修饰的 mRNA上ZNF598招募明显增加，说明m 1 Ψ更容易导致核糖体碰撞。这些结果表明， m 1 Ψ虽然可以提高核糖体装载，但它显著减慢翻译延伸，导致核糖体堆积、碰撞和质控介入，从而降低有效蛋白产量。相比之下，ac 4 C只适度减慢延伸，使核糖体能够更高效地产生完整蛋白。因此，ac4C的优势不是装载更多核糖体，而是维持了更合适的翻译延伸速率。

已有研究表明，核糖体碰撞可能诱导核糖体移码。移码会改变阅读框，产生截短蛋白或异常肽段，可能形成非预期新抗原。因此，作者进一步去研究 m 1 Ψ是否更容易引发翻译错误？ac 4 C是否能在提高蛋白产量的同时维持更高翻译准确性？作者设计了萤火虫荧光素酶移码报告系统。在移码报告系统中，只有核糖体发生+1移码，才能产生全长荧光素酶。作者分别测试富尿苷序列和富胞苷序列。结果显示，m 1 Ψ在富尿苷序列中明显诱导+1移码，而ac 4 C在富胞苷序列中没有诱导类似程度的移码。进一步的核糖体测序显示，m 1 Ψ在富尿苷区域造成核糖体暂停和核糖体积累，符合核糖体堆积或碰撞特征。相反，ac 4 C没有造成明显核糖体停滞。这些结果表明，m1Ψ在富尿苷序列中更容易造成核糖体暂停、核糖体碰撞和核糖体移码；ac4C虽然也会适度降低翻译延伸速率，但不会造成类似的核糖体堆积和高水平移码，因此可以在提高蛋白产量的同时维持更好的翻译保真度。

总的来说，作者发现 ac 4 C是一种区别于m 1 Ψ的 synthetic mRNA修饰策略。它能够在保持低免疫原性的同时，提高蛋白产量，并减少由核糖体慢延伸、碰撞和+1 核糖体移码导致的翻译错误风险。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-026-10729-8

制版人：十一

参考文献

1. Rohner, E., Yang, R., Foo, K. S., Goedel, A. & Chien, K. R. Unlocking the promise of mRNA therapeutics.Nat. Biotechnol.40, 1586–1600 (2022).

2. Andries, O. et al. N1-methylpseudouridine-incorporated mRNA outperforms pseudouridine-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reduced immunogenicity in mammalian cell lines and mice.J. Control. Release217, 337–344 (2015).

3. Mulroney, T. E. et al. N1-methylpseudouridylation of mRNA causes +1 ribosomal frameshifting.Nature625, 189–194 (2024).

4. Monroe, J. et al. N1-Methylpseudouridine and pseudouridine modifications modulate mRNA decoding during translation.Nat. Commun.15, 8119 (2024).

5. Svitkin, Y. V., Gingras, A. C. & Sonenberg, N. Membrane-dependent relief of translation elongation arrest on pseudouridine- and N1-methyl-pseudouridine-modified mRNAs.Nucleic Acids Res.50, 7202–7215 (2022).

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（*排名不分先后）