Vita | 曹龙兴团队实现“可编程”的定制化蛋白酶设计|复合物|多肽|底物|曹龙兴|活性|蛋白酶

蛋白酶作为生命体内负责水解多肽链的生物催化剂，在维持蛋白质稳态中发挥着至关重要的作用。凭借其能够直接切割特异性氨基酸序列的能力，蛋白酶在针对由体内异常蛋白聚集引发的难治性疾病的靶向降解领域具有巨大的应用前景。许多重大疾病（如神经退行性疾病）的发生和发展，往往是由特定病理蛋白在组织中的异常聚集所驱动。因此，直接降解并清除这些过度堆积的异常蛋白，已成为逆转疾病进程的关键策略之一。以阿尔茨海默病（AD）为例，其核心致病因子——淀粉样蛋白β（Aβ）在脑内的异常聚集，被认为是推动疾病进展的主要机制。目前，主流的抗体疗法虽然证明了靶向清除病理蛋白的有效性，但由于体内致病蛋白丰度较高以及跨血脑屏障的阻碍，静态结合模式在清除效率上常常面临瓶颈。相比之下，蛋白酶具备出色的“催化周转”能力，单个酶分子即可连续降解成百上千的底物分子，在高效、低剂量清除病理蛋白方面具有独特优势。

然而，要开发能够高精度靶向切割特定肽键的蛋白酶，仍面临两道极难跨越的技术壁垒。一方面，肽键本身极为惰性：在生理条件下，其自发水解的半衰期长达400至600年，这要求所开发的酶必须在底物周围形成亚埃级的精确催化环境，以打破肽键的高能垒。另一方面，多肽底物具有高度柔性和多样的构象，使其极难被酶催化口袋所精准锁定和识别。传统蛋白质工程虽然可以通过高通量筛选获得功能改造的酶，但由于蛋白酶的底物结合位点与催化活性中心高度精密且协同，对底物的序列与结构特异性要求极高，这导致现有高通量筛选手段很难在巨大的序列空间内直接筛选出兼具高效催化与严格底物选择性的蛋白酶，而且筛选效率和通量也常常不能满足复杂催化需求。与此同时，传统的蛋白质设计方法受限于建模精度，以及过往设计策略无法充分捕捉和描述酶—底物体系中底物高柔性带来的构象多样性，难以有效预测并优化相应的催化口袋结构，从而使得“高效催化”与“序列特异性识别”难以兼顾，进一步限制了新型蛋白酶的从头设计。

2026年7月，西湖大学生命科学学院及人工智能药物设计核心实验室曹龙兴研究员团队，在Vita发表研究论文De novodesign of metalloproteases for targeted amyloid-β cleavage。研究团队应用自主开发的的基于流模型的蛋白质生成模型ProteusFlow，通过将目标肽序列与预定义催化基序作为条件，成功实现了底物序列特异性蛋白酶的从头设计。这一成果不仅实现了具备高度序列选择性的金属蛋白酶的“从头设计”，也标志着人工智能在打破天然酶底物偏好性限制、开发“可编程”定制化蛋白酶方面迈出了关键一步。

为实现这种“可编程”的定制化蛋白酶设计，研究团队引入了全新的全局重构视角。从蛋白质设计和酶工程的角度来看，相较于在天然酶支架上进行复杂的序列突变和多轮定向进化，运用生成式人工智能进行全局骨架重构，能够在解决多肽底物识别特异性和催化过渡态捕获等微观动态挑战时展现出深层次的建模优势。蛋白质设计能够以底物序列为起点，从头生成全新的蛋白质骨架结构，从而突破了传统天然蛋白酶在进化过程中为维持原有催化特异性而形成的适应性构象限制。这不仅可以提升底物结合槽的空间可塑性，从而为精准包裹柔性多肽底物奠定结构基础。基于蛋白酶催化的基本原理与全新的蛋白质生成模型ProteusFlow，研究团队成功实现了理论到实践的转化，确立了精准定制人工蛋白酶的结构生成路线。

研究团队首先从代表性锌离子依赖型内肽酶（PPEP-1与Fungalysin）的提取出核心催化基序，以此作为蛋白酶生成的“空间锚点”。基于这些锚点，团队基于ProteusFlow模型开发了创新的“两步包裹（two-step encapsulation）”蛋白酶设计策略。不同于一次性结构生成容易导致的局部结构疏松堆叠，该策略就像打造一把精密的“分子夹钳”：第一步先围绕启动反应的核心催化氨基酸构建稳定的底座结构，初步承托住目标多肽；第二步则依据另一关键催化部件的几何特征生成另一半结构，最终完成对过渡态多肽底物的严密包裹与精准识别。利用这种循序渐进的生成方式，研究团队成功构建了能够高度识别底物序列的夹钳状（clamp-like）金属蛋白酶骨架。为了验证这一创新生成策略的实际有效性，研究团队将目标聚焦于阿尔茨海默病核心致病因子——淀粉样蛋白β（Aβ），并针对其易于聚集的关键区域内的三个独立切割位点设计了多种锌离子金属蛋白酶。在这些设计中，多个人工酶均展现出显著的底物切割活性。其中人工酶 DP622‑S2 表现尤为突出，其底物亲和力可达微摩尔水平（Km = 5.87 μM）；相较于肽键自发水解的本底反应速率，该人工酶的催化效率提升幅度高达 10⁷倍。这一成果初步验证了该全新生成策略在实际应用中的可行性。

图一. 利用ProteusFlow模型 “两步包裹”生成人工酶

为了进一步探究这些从头设计蛋白酶对底物的特异性识别机制，研究团队通过高分辨率冷冻电镜（Cryo-EM）成功捕获了三个人工酶与Aβ42底物的复合物结构。结构显示，底物以清晰的β折叠构象被精确锁定在人工酶的催化结合口袋内。实验解析出的复合物构象与计算设计模型高度吻合，核心催化几何结构得到了精准还原。这一结构证据直接证实了从头设计的蛋白酶骨架能够对高柔性多肽实现精准包裹与特异性识别。

图二. 冷冻电镜解析三个人工酶与Aβ42底物的复合物结构

为进一步提升人工酶对复杂底物的催化效能，研究团队利用ProteusFlow模型，对人工酶骨架进行了结构引导的两阶段原子级精度优化。通过对底物结合界面进行精准的局部结构重采样和相互作用网络的扩展，团队成功获得了OP609-S2与OP669-S2两个性能更优的变体。在优化过程中，酶与底物之间的结构互补性得到了有效增强，使这些人工酶在保持极高底物选择性的同时，催化效率实现了近十倍的显著提升。更值得一提的是，优化后的人工酶能够将高度致病性的全长Aβ42彻底降解为无毒的良性短肽片段。这一突破性的实验结果，有力证明了蛋白质生成模型在精细调控和持续强化酶—底物亲和力方面的巨大潜力。

总体而言，本研究通过开发前沿的蛋白质生成模型，成功突破了传统蛋白质理性设计在识别柔性底物和设计高壁垒化学反应酶时面临的技术瓶颈。团队提出的“两步包裹”生成策略，不仅为开发具有高度单肽键选择性的人工蛋白酶提供了一套高效且通用的新方法，更在概念层面验证了通过从头设计定制化酶来实现精准清除病理蛋白的可行性。这一高度可编程的分子降解工具，有望为包括阿尔茨海默病在内的淀粉样蛋白病变，以及更多传统靶向机制难以突破的难治性疾病，开创基于“直接催化降解”的全新治疗路径。目前，研究团队正进一步沿着这一方向推进，在动物体内开展Aβ清除实验，力图将这种从头设计的人工蛋白酶发展为阿尔茨海默病等疾病治疗的新型蛋白药物，提供全新的疾病干预方案。