Sci Adv | 任兵团队人类视网膜单细胞多组学图谱揭示眼病非编码风险变异调控机制|rpe|染色质|特异性|细胞|视网膜

视网膜是人类视觉系统中高度特化的神经组织，负责将光信号转化为神经信号，并通过复杂的细胞网络传递至大脑。视网膜及其相邻的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）在维持视觉功能中发挥关键作用，其异常与年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、青光眼以及多种遗传性视网膜疾病密切相关。

近年来，全基因组关联研究（GWAS）已经发现了大量与眼部疾病相关的遗传风险位点。然而，这些风险变异大多位于基因组的非编码区域，并不直接改变蛋白质序列。它们如何通过影响特定细胞类型中的调控元件、基因表达程序和染色质空间结构来参与疾病发生，仍然缺乏系统性的解析。一个重要原因是，人类视网膜不同细胞类型的转录调控元件、DNA 甲基化状态以及三维染色质结构仍未被充分注释。

近日，美国加州大学圣地亚哥分校任兵教授团队、Radha Ayyagari 教授团队及 UCSD 其他合作实验室在 Science Advances 在线发表题为 Single-cell analysis of the epigenome and 3D chromatin architecture in the human retina 的研究论文。该研究由博士生袁瑛为第一作者，任兵教授和 Radha Ayyagari 教授为共同通讯作者。作为一项跨实验室合作研究，该工作结合单细胞多组学、表观基因组学、三维基因组学和计算基因组学方法，系统绘制了人类视网膜、黄斑以及RPE/脉络膜组织的转录组、染色质开放性、DNA甲基化和三维基因组图谱，为理解人类视网膜细胞类型特异性基因调控程序及眼部疾病相关遗传变异机制提供了重要资源。

构建人类视网膜单细胞多组学图谱

为了系统解析人类视网膜的细胞类型特异性调控景观，研究团队对来自健康供体的人类视网膜、黄斑以及 RPE/脉络膜组织开展了单细胞多组学测序。研究同时应用了 10x single-nucleus multiome 技术，联合检测同一细胞核中的基因表达和染色质开放性，以及 single-nucleus methyl-3C sequencing（snm3C-seq）技术，用于解析单细胞水平的 DNA 甲基化和三维染色质结构。

通过整合这些互补的单细胞组学数据，研究团队获得了超过 58,000 个细胞核的多层次信息，并对视网膜、黄斑和 RPE/脉络膜中的主要细胞类型进行了系统注释。这些细胞类型包括视杆细胞、视锥细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、神经节细胞、Müller 胶质细胞、RPE 细胞以及脉络膜相关细胞类型等。

这一图谱不仅揭示了不同视网膜细胞类型的转录表达特征，也进一步描绘了它们在染色质开放性、DNA 甲基化和三维基因组结构层面的差异，为理解人类视网膜细胞身份的建立和维持提供了多维度参考。

鉴定细胞类型特异性顺式调控元件

基因表达的细胞类型特异性，很大程度上由增强子、启动子等顺式调控元件控制。研究团队基于单细胞染色质开放性数据，在人类视网膜及 RPE/脉络膜中系统鉴定了 420,824 个候选顺式调控元件（candidate cis-regulatory elements, cCREs），并进一步解析了它们在不同细胞类型中的活性模式。

结果显示，不同视网膜细胞类型具有高度特异的调控元件组合。例如，光感受器细胞、Müller 胶质细胞和 RPE 细胞在关键细胞身份基因附近呈现出明显不同的染色质开放模式。这些细胞类型特异性开放区域富集了相应的转录因子结合基序，提示它们可能参与调控不同细胞类型的发育、功能维持及疾病易感性。

此外，研究还结合 DNA 甲基化信息，对不同细胞类型中的差异甲基化区域进行了分析。DNA 甲基化与染色质开放性共同构成了细胞类型特异性调控状态的重要组成部分，也为理解视网膜细胞命运和功能提供了更完整的表观遗传背景。

单细胞水平解析人类视网膜三维基因组结构

基因组并不是线性地存在于细胞核中，而是折叠形成复杂的三维结构。染色质的空间折叠方式会影响增强子与靶基因启动子之间的相互作用，从而参与调控基因表达。然而，由于视网膜组织细胞类型复杂，过去很难在特定细胞类型分辨率下解析其三维基因组结构。

本研究通过 snm3C-seq 在单细胞水平同时获取 DNA 甲基化和染色质构象信息，从而得以比较不同视网膜细胞类型中的三维染色质组织模式。研究发现，不同细胞类型在染色质接触距离、拓扑结构域以及边界区域等方面具有显著差异。

在典型视网膜功能基因位点，例如 Müller 胶质细胞标记基因 RLBP1 和 RPE 标记基因 RPE65 附近，研究团队观察到细胞类型特异性的染色质结构特征。这些结果说明，视网膜细胞身份不仅体现在基因表达和染色质开放性层面，也深刻体现在基因组空间组织方式上。

人鼠比较揭示保守与分化的视网膜调控程序

小鼠是视网膜发育和眼病研究中最常用的模式生物之一。然而，人类与小鼠视网膜在解剖结构、细胞比例和疾病易感性方面均存在差异。因此，系统比较人类与小鼠视网膜的调控元件，有助于理解哪些调控程序在进化中保守，哪些可能具有人类特异性。

研究团队将人类视网膜单细胞转录组和染色质开放性图谱与小鼠视网膜数据进行整合分析，鉴定出不同类别的人类调控元件，包括在人鼠之间序列和开放状态均保守的调控元件、序列保守但开放状态不同的调控元件，以及人类特异性调控元件。

这一分析揭示了人类和小鼠视网膜细胞之间既存在共享的核心调控程序，也存在显著分化的调控景观。尤其是在 Müller 胶质细胞等细胞类型中，人类特异性或分化的调控元件可能与人类视网膜特有的生物学功能和疾病机制相关。

结合深度学习解析眼病非编码风险变异

眼部疾病相关遗传变异大多位于非编码区域，其功能解释一直是遗传学和基因组医学中的难点。本研究利用细胞类型分辨率的视网膜调控图谱，进一步解析眼部疾病和视觉相关性状的遗传风险位点。

研究团队首先评估了 GWAS 风险变异在不同视网膜细胞类型调控元件中的富集情况，发现多种眼部疾病和相关性状的风险变异呈现细胞类型特异性富集。这提示不同疾病可能主要通过影响特定视网膜细胞类型中的调控元件而发挥作用。

进一步地，研究团队结合染色质开放性、增强子-基因连接模型和深度学习序列模型，对非编码风险变异的潜在功能影响进行了预测。通过 in silico mutagenesis，研究能够评估特定位点的核苷酸改变是否可能影响特定细胞类型中的染色质可及性，从而推断其对基因调控的潜在影响。

在部分候选位点中，研究还通过 CRISPR 编辑实验对深度学习模型的预测进行了验证，进一步支持了该图谱在解释眼病非编码遗传变异中的应用价值。

研究意义

总体而言，该研究构建了目前较为系统的人类视网膜单细胞转录组、表观基因组和三维基因组资源。与单一组学图谱相比，本研究的优势在于同时整合了基因表达、染色质开放性、DNA甲基化和染色质空间结构，从多个层面刻画了视网膜及RPE/脉络膜细胞类型特异性的基因调控网络。

这一资源将有助于研究者回答一系列关键问题：不同视网膜细胞类型如何建立和维持自身身份？疾病相关非编码变异可能作用于哪些细胞类型和调控元件？人类与小鼠视网膜之间哪些调控机制保守，哪些发生了进化分化？三维基因组结构如何参与视网膜特异性基因表达调控？

随着单细胞组学、三维基因组学和人工智能方法的发展，细胞类型分辨率的调控图谱正在成为连接遗传变异、基因调控和疾病机制的重要桥梁。本研究为眼部疾病的遗传机制解析、功能基因组学研究以及未来潜在的精准医学应用提供了基础数据资源和分析框架。

为方便领域研究者进一步使用这一资源，研究团队同时建立了可公开访问的人眼表观基因组资源平台 Eye Epigenome Browser（https://epigenome.wustl.edu/EyeEpigenome/）。该平台可用于查询人类视网膜、黄斑、RPE/脉络膜等组织区域中不同细胞类型的基因表达、染色质开放性及候选调控元件活性，并辅助研究者探索眼病相关遗传变异的潜在调控机制。

此外，为促进社区复用，研究团队还同步公开了完整分析流程及用于 in silico mutation effect prediction 的计算工具。该工具整合了本研究构建的人类视网膜细胞类型特异性调控图谱和深度学习序列模型，可用于评估候选非编码变异或人工引入的序列突变对染色质可及性及调控活性的潜在影响。研究者可利用该资源对眼病 GWAS 风险位点或其他感兴趣的非编码变异进行计算扰动分析，从而为功能验证和疾病机制研究提供候选线索。

需要指出的是，该计算工具并非临床诊断模型，而是面向功能基因组学研究的开放资源，主要用于帮助研究者在细胞类型特异性调控背景下优先筛选可能具有功能影响的候选非编码变异。相关代码、示例输入文件、预训练模型及分析说明已在 GitHub 公开，并通过 Zenodo 进行永久归档，便于社区长期访问、复现和二次开发。

GitHub: https://github.com/yingyuan830/human_retina Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.21465091

本研究相关原始测序数据已通过 GEO、4DN 及 Eye Epigenomics portal 公开。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adv9162

制版人：十一

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（*排名不分先后）