祝贺！史无前例代谢领域必看的一篇Nature，以后将成为常态！|dna|介导|克隆|微生物|组学|转录组

开篇导读

传统路径中解析组织乃至全谱尺度的代谢物组成与动态变化规律，往往发端于“孤立”的生物样本采集和液相色谱-质谱联用检测，须经历冗长的峰对齐、谱库匹配与统计建模过程。此处的“孤立”并非研究者的取样方案欠缺考量，实则源于技术瓶颈的牵制，无异于“见微知著”。化学多样性（数千至上万种代谢物）与检测通量的固有矛盾，使得该模式对生物体内源代谢网络的全局感知充斥着大量盲区与偏差。

而AI基础模型（AI Foundation Models）的入局，则从根本上颠覆了既有工作流，驱动其向全景智慧解析蜕变。基础模型通过对海量多源异构信息（如高分辨质谱原始数据、核磁共振谱图、色谱保留行为、碎片裂解规律、生化反应数据库及公共代谢组学存储库）的自主化表征学习，能够建立覆盖数万种已知与未知代谢物的高置信度结构鉴定与丰度预测网络，不再是依赖标准品比对和数据库检索的有限推断，而是直接描摹那些“代谢与表型关联最紧密”区域的分子变动轨迹。更进一步，基础模型拥有杰出的多模态融合与长程依赖捕获本领，例如在肿瘤代谢重编程或植物逆境应答研究中，它能同步解构微环境氧压变化、关键酶活性波动、辅因子再生循环、信号转导级联与转录调控程序之间的统筹协同，进而精准锁定核心差异代谢物与潜在生物标志物。

参会对象

高校师生：涉及代谢组学、生物化学与分子生物学、分析化学、药学、医学、植物科学、食品科学与营养健康、生物信息学等相关专业的教师、博硕研究生及高年级本科生。

科研人员：从事代谢通路解析、生物标志物发现、代谢流分析、疾病代谢重编程、植物次生代谢调控、肠道菌群代谢互作等领域的研究人员。

企业技术与管理人员：来自生物医药CRO/CDMO公司、精准医学检测服务商、食品与营养健康企业、合成生物学初创公司、代谢工程技术开发机构、组学大数据分析平台的技术研发与项目管理人员。

针对性痛点与课程价值

倘若您是正处学术攻坚期的硕博研究生，正面临SCI选题方向趋同、传统代谢物鉴定覆盖率低、低丰度成分难以捕获、多组学整合缺乏系统框架的窘境——那么，本课程正是为您量身打造的解局利器！AI基础模型驱动代谢组学智能解析已成为Nature Biotechnology、Nature Methods、Analytical Chemistry、Molecular & Cellular Proteomics、Microbiome等顶刊争相报道的前沿热点（近五年涉及深度学习代谢结构预测、质谱数据智能去卷积、代谢通路动态模拟的论文呈井喷式增长）。贯通AI基础模型与代谢组学的前沿研究范式，不仅能助您高效整合色谱-质谱数据、基因组注释与表型信息，搭建高覆盖度代谢物精准鉴定与通路扰动评估一体化平台，更能大幅提升论文创新高度与审稿接纳率，为毕业答辩、博士后申请、跻身国际顶尖代谢组学研究团队与头部生物医药/精准检测企业（如METABOLON、Scripps Research代谢组学中心、中国科学院大连化物所、华大基因、诺禾致源、帕诺米克、百趣生物、麦特绘谱等）铸就极具分量的竞争筹码。

2026最热门专题

专题一：

AI大模型代谢多组学

专题二：

AI大模型微生物多组学组学

专题三：

AI育种

AI大模型代谢组学

学习目标

1. 熟悉代谢组学、AI 大模型调用和机器学习相关背景知识以及硬件和软件；

2. 入门R 语言、AI模型的调用以及机器学习理论和常规使用；

3. 掌握代谢组学从样本处理到上下游数据分析以及出图的全流程；

4. 能借助AI 大模型复现CNS 及其子刊级别杂志中代谢组学相关文章中的图片；

5.能灵活熟练地借助AI 大模型分析自己的代谢组数据并尝试联合多组学分析。

讲师介绍

来自顶尖985高校神经科学，长期致力于利用AI智能体（Agent）、机器学习、代谢组学、转录组学、单细胞组学及分子生物学等多学科技术，系统研究神经内科慢性病的发病机制、生物标志物开发及临床预防与治疗策略。在代谢组学方向，精通高效液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术，覆盖非靶向与靶向代谢组学的全流程——从样本制备到AI驱动的数据分析；在多组学大数据整合中，擅长运用AI Agent与生物信息学方法进行自动化、智能化的数据挖掘与解析。研究成果在Neuron, J Clin Invest, EBioMedicine, Cell Death Dis, Cell Death Discov, Nanotoxicology 等期刊发表SCI论文11篇。

AI大模型微生物多组学

学习目标

1.了解微生物多组学相关概念

2.了解机器学习相关概念和常用的机器学习模型

3.了解R语言

4.掌握常用的微生物多组学数据分析以及机器学习相关R包的使用

5.掌握二分类模型，多分类模型以及拟合模型的构建

6.了解AI大模型，并使用大模型辅助代码编写、纠错、文献解读、结果总结与自动报告生成

7.复现SCI文章

专为零基础/科研萌新设计，补齐R语言、科研绘图短板，全程本地AI赋能、数据不外泄。从R基础语法到期刊绘图，从微生物单组学到多组学整合，再到机器学习建模，五天循序渐进，零门槛掌握整套微生物生信科研流水线，所有代码可直接用于课题、毕业论文、SCI图表。

讲师介绍

来自全国重点大学、生物信息学教授，有十余年的测序数据分析经验。研究领域涉及机器学习，芯片数据分析，核酸及蛋白序列分析，宏基因组学，DNA，RNA，甲基化测序数据分析，单细胞测序数据分析，miRNA及靶基因分析，生存分析及预后模型构建等。具有丰富的培训经验，培训内容涉及机器学习在生物医学中的应用，机器学习在微生物学中的应用，机器学习在蛋白组学中的应用，单细胞多组学数据挖掘，WGCNA共表达网络构建，ceRNA网络构建，R语言基础等。发表SCI论文30余篇，其中一作及并列一作15篇，h指数20。

AI育种

学习目标

1.系统掌握基因编辑核心原理：深入理解CRISPR-Cas9等主流工具的基本机制、技术演进（如碱基编辑、引导编辑、桥式重组酶等）及其“可编辑边界”的拓展逻辑。

2. 贯通从实验室到田间的应用链路：了解基因编辑在作物育种中的实际流程，包括安全证书审批、国内外商业化现状，并能独立设计一个完整的作物性状改良基因编辑方案。

3. 掌握基因编辑系统的优化策略：学会针对不同目标（如效率、特异性、大片段插入等）对编辑系统进行设计和改进。

4. 熟练操作常用生物学软件与AI工具：能够运用AlphaFold、ESM3、Evo 2等生物大模型，以及ChatGPT（Codex）、Claude Code等Agent工具，高效完成文献检索、sgRNA设计、载体构建、数据分析及报告产出等任务。

5. 具备独立的科研实战能力：能够将AI嵌入实际实验环节，整合原理、工具与数据，自主解决基因编辑研究中的具体问题，并为未来在农业育种或基础研究中的创新应用打下基础。

讲师介绍

本课程主讲人为基因编辑领域资深老师，进入基因编辑领域已近 10 年，完整经历了从 CRISPR- Cas9 敲除体系到碱基编辑、引导编辑的技术迭代。

研究工作覆盖基因编辑全流程：靶基因筛选与 sgRNA / pegRNA 设计、载体构建与多重编辑策略、作物遗传转化与原生质体瞬时表达体系、编辑效率与脱靶评估、编辑株系的分子检测与高通量测序数据分析，并在水稻上建立了稳定的编辑与再生体系。近两年重点关注 AI 工具在基因编辑中的落地应用，包括深度学习模型辅助的 sgRNA / pegRNA 效率预测、结构预测与蛋白语言模型指导的编辑器改造，以及 Agent 工具在文献调研、实验设计与测序数据分析中的工程化使用。

已发表 SCI 论文数十篇，参与国家重点研发计划项目 1 项。具有实验室技术培训与研究生实验带教经验，培训内容涉及 CRISPR 载体构建实操、碱基编辑与引导编辑方案设计、多重编辑策略、SnapGene 与编辑数据分析软件使用、AI 工具在科研工作流中的应用等。

授课风格强调"从原理到能上手"：以真实实验中会遇到的问题和农业育种落地案例为主线，每个技术点都讲清楚"什么时候该用它、什么时候不该用它"，并配套可直接复用的设计模板与分析脚本。

课程大纲内容

college preference

PART01

专题一：AI大模型代谢组学

第一天上午：

A1 代谢物及代谢组学的发展与应用

（1）代谢与生理过程；

（2）代谢与疾病；

（3）非靶向与靶向代谢组学；

（4）空间代谢组学与质谱成像（MSI）；

（5）代谢组学与药物和生物标志物；

（6）代谢组学联合其他组学分析思路；

（7）代谢流与机制研究。

A2 代谢通路及代谢数据库

（1）几种经典代谢通路简介；

（2）三大常见代谢物库：HMDB、METLIN 和 KEGG;

（3）代谢组学原始数据库：Metabolomics Workbench 和 Metabolights.

A3 参考资料推荐

第一天下午：

A4 代谢组学实验流程简介

A5 色谱、质谱硬件与原理解析

（1）色谱分析原理与构造；

（2）色谱仪和色谱柱的选择；

（3）色谱的流动相：梯度洗脱法；

（4）离子源、质量分析器与质量检测器解析；

（5）质谱扫描模式分析原理及动画演示；

（6）色谱质谱联用技术（LC-MS）；

第二天上午：

B1 代谢物样本处理与抽提

（1）各种组织、血液和体液等样本的提取流程与注意事项；

（2）代谢物抽提流程与注意事项；

（3）样本及代谢物的运输与保存问题；

B2 LC-MS 数据质控与搜库

（1） LC-MS 实验过程中 QC 和 Blank 样本的设置方法；

（2） LC-MS 上机过程的数据质控监测和分析；

（3）代谢组学上游分析原理——基于 Compound Discoverer 与 Xcms 软件；

（4） Xcms 软件数据转换、提峰、峰对齐与搜库；

第二天下午：

B3 R 语言基础与 AI 大模型调用

（1） R 和 Rstudio 的安装；

（2） Rstudio 的界面配置；

（3） AI 大模型调用；

（4） R 中的基础运算和统计计算；

（5） R 中的包：包，函数与参数的使用；

（6） R 语言语法：数据类型与数据结构；

（7） R 基础画图；

B4 R 语言画图利器——ggplot2 包

（1） ggplot2 简介

（2） AI 大模型辅助总结与解析

（3） ggplot2 的画图哲学；

（4） ggplot2 的配色系统；

（5） ggplot2 数据挖掘与作图实战；

第三天上午：AI 大模型辅助机器学习

C1 有监督式机器学习在代谢组学数据处理中的应用

（1） AI 大模型对机器学习在代谢组学中作用的解析；

（2） AI 大模型辅助了解人工智能、机器学习、深度学习的关系；

（3）回归算法：从线性回归、Logistic 回归与 Cox 回归讲起；

（4） PLS-DA 算法：PCA 降维后没有差异的数据还有救吗？

（5） VIP score 的意义及选择；

（6）分类算法：决策树，随机森林和贝叶斯网络模型；

C2 一组代谢组学数据的分类算法实现的 R 演练

(1) AI 大模型数据解读；

(2) AI 大模型演练与操作；

第三天下午：

C3 无监督式机器学习在代谢组学数据处理中的应用

（1） AI 大模型解析非监督式机器学习

（2）大数据处理中的降维；

（3） PCA 分析作图；

（4）三种常见的聚类分析：K-means、层次分析与 SOM

（5）热图和 hcluster 图的 R 语言实现；

C4 一组代谢组学数据的降维与聚类分析的 R 演练

(1) AI 大模型数据解析；

(2) AI 大模型演练与操作；

第四天上午：

D1 在线代谢组分析网页 Metaboanalyst 操作

（1）用 R 将数据清洗成网页需要的格式；

（2）独立组、配对组和多组的数据格式问题；

（3） Metaboanalyst 中的上游分析（原始数据峰提取、峰对齐与搜库）

（4） Metaboanalyst 的 pipeline 以及参数设置和注意事项；

（5） Metaboanalyst 的结果查看和导出；

（6） Metaboanalyst 的数据编辑；

（7）全流程演练与操作；

（8）代谢联合多组学分析网页操作。

第四天下午：

D2 代谢组学数据清洗与 R 语言进阶

（1）代谢组学中的 t、fold-change 和响应值；

（2） AI 大模型进行数据清洗流程；

（3） R 语言 tidyverse；

（4）数据预处理：数据过滤与数据标准化（样本的 Normalization 和代谢物的 Scaling）；

（5） AI 大模型完成代谢组学数据清洗演练与总结；

第五天上午：

E1 文献数据分析部分复现（1 篇）

（1） AI 大模型辅助文献深度解读；

（2） AI 大模型练习讲解：从原始数据下载到图片复现；

（3）学员练习使用 AI 大模型实现图片复现。

第五天下午：

E2 AI 大模型辅助代谢组学顶刊解读（3 篇）；

（1） Neuron 一篇有关人脑代谢吸收和产生的代谢物种类的代谢图谱类的文献；(数据库型)

（2） Nature communication 一篇胃癌患者血浆代谢组学使用机器学习得出预测模型用于胃癌的诊断和预后的文献；(血液生物标志物型)

（3） Nature 一篇对胰腺癌患者肠道菌群的代谢组学分析找到可以提高化疗效果的代谢物的文献。(机制研究型)

示例图片：

college preference

PART02

专题二：AI大模型微生物多组学

第一天

机器学习，AI大模型及微生物多组学简介

1.机器学习基本概念介绍

2.常用机器学习模型介绍

3.混淆矩阵

4.ROC曲线

5.微生物组学介绍

6.代谢组学介绍

7.转录组学介绍

8.AI大模型简介

R语言简介及实操

1．R语言概述

2．R软件及R包安装

3．R语言语法及数据类型

4．条件语句

5．循环

6．函数

7．R调用AI大模型

8．本地AI辅助：语法报错实时纠错、代码改写、逻辑讲解

1．AI一键优化粗糙代码为期刊级代码

2．AI自动添加组间显著性标记、误差线、分组注释

3．AI根据数据类型推荐最优图表样式、配色方案

第二天

AI辅助解读机器学习在微生物多组学中的应用案例

1．利用机器学习基于微生物组学数据预测宿主表型和疾病状态

2．利用机器学习基于微生物组学+代谢组学数据预测样本类型

3．利用机器学习预测微生物风险

4．整合微生物组学数据和代谢组学数据鉴定疾病相关模块

5．肿瘤研究中微生物组学+宿主转录组学+免疫联合分析

常用数据库介绍

NMDC

Microbiome Learning Repo

14套肠道微生物+代谢数据

Curated Metagenomic Data

GEO

AI大模型辅助查找微生物多组学数据

第三天

植物年龄、基因型和环境对多年生植物的叶和根中微生物组的影响的研究（实操）

1.植物根和叶中微生物丰度分析

2.根和叶中α-diversity，β-diversity分析，AI解读统计学结果与生物学意义。

3.进化树构建

4.降维分析

5.基于OTU的差异丰度分析，热图，箱型图绘制

6.显著差异菌群筛选，AI批量注释菌属功能，生成标准化解读报告。

7.微生物biomarker鉴定，AI解读biomarker

8.生信专用Prompt模板库搭建

利用机器学习基于微生物组学数据预测宿主表型(二分类变量以及连续变量)

1.加载数据（三套数据）

2.数据归一化

3.OTU特征处理

4.机器学习模型构建（RF, KNN, SVM, Lasso等9种机器学习方法）

5.5倍交叉验证

6.绘制ROC 曲线，比较不同机器学习模型，AI一键美化成期刊标准图

7.AI解读标志物功能与临床价值

8.模型性能评估

第四天（实操+复现）

利用机器学习基于海洋微生物多组学进行分类研究

1.海洋微生物群落结构分析

2.海洋不同区域/深度分组差异

3.环境因子驱动分析

4.多组学整合分析

5.机器学习分类

6.利用AI大模型自动生成结果解释与论文级报告

整合微生物组学和代谢组学数据鉴定疾病相关模块

7.微生物组学和代谢组学数据整合

8.鉴定疾病相关的多组学模块

9.模块交集分析

10.利用机器学习基于模块预测疾病状态

11.重要模块分析，重要模块的AI智能解读

第五天（实操+复现）

肿瘤研究中微生物组学，宿主转录组学和免疫联合分析

1.微生物组学分析

2.AI自动生成转录组分析流程，鉴定差异表达基因

3.通过CCA方法对微生物组学数据和宿主转录组学数据进行整合

4.微生物免疫关联分析，AI注释两两互作机制与通路

基于微生物多组学数据，利用集成模型进行二分类和连续变量预测

1.微生物组和代谢组+贝叶斯集成模型进行炎性肠病分类预测，并进行五倍交叉验证，外部独立队列验证

2.整合六个组学数据+贝叶斯集成模型预测妊娠年龄，进行留一法验证

3.集成多组学模型的预测效果与单一组学预测效果比较

4.AI大模型实现图片复现

部分案例图片：

college preference

PART03

专题三：AI育种

五天课程内容简要概括：

第一天：基因编辑基础原理与工具

你将获得的技能与知识：

• 掌握基因编辑与转基因的本质区别，以及中、美、日、欧的监管差异

• 了解从早期 ZFNs 到最新 CRISPR 系统的基因编辑技术演进

• 深入理解 CRISPR-Cas9 的分子机制及其应用方式

• 认识新一代高精度基因编辑工具（Cas12 家族、CasΦ、CasMINI、IscB/TnpB）的特点与优势

• 了解大片段整合的新范式（CAST、PrimeRoot、桥式重组酶）

• 熟练使用 SnapGene 软件进行分子克隆设计

• 建立 AI 辅助科研的基本工作流，能用 Agent 完成结构化靶基因调研

第二天：CRISPR 系统应用实操与拓展功能

你将获得的技能与知识：

• 掌握 sgRNA 设计原则与辅助工具使用，尤其是多倍体作物同源基因策略

• 学会 CRISPR-Cas9 敲除载体的构建流程

• 理解作物遗传转化与再生的瓶颈及提效策略（GRF-GIF、无外源 DNA 编辑）

• 理解多基因同时编辑的策略与方法

• 掌握 CRISPRa/CRISPRi 基因表达调控系统与表观编辑

• 掌握顺式调控元件编辑创造数量性状连续变异的育种策略

• 能用 AI 工具批量完成 sgRNA 打分与测序数据的编辑效率统计

第三天：碱基编辑系统原理与应用

— 2 —你将获得的技能与知识：

• 全面了解胞嘧啶碱基编辑（CBE）系统的发展与应用

• 掌握腺嘌呤碱基编辑（ABE）系统的工作原理与 ABE8e 等最新版本

• 理解蛋白质定向进化技术在基因编辑中的应用

• 认识双碱基编辑及新型碱基编辑系统（CGBE、AYBE、gGBE）

• 掌握细胞器碱基编辑（DdCBE、TALED）

• 学会碱基编辑技术在农业育种中的应用策略与脱靶评估

• 会使用结构预测与序列大模型（AlphaFold 3、ESM3、Evo 2）辅助工具改造

第四天：高级基因编辑技术与细胞应用

你将获得的技能与知识：

• 掌握基因编辑报告系统的设计与使用

• 学会原生质体制备技术并应用于基因编辑

• 理解 Prime Editing 精准编辑系统的原理与植物专用优化（ePPE、epegRNA）

• 学习大片段 DNA 的插入与删除技术（DualPE、PrimeRoot、CAST、Bridge RNA）

• 能用 Agent 工具搭建 pegRNA 设计与 NGS 数据分析的小型流水线

第五天：系统优化、产业化与伦理安全

你将获得的技能与知识：

• 掌握 Prime Editing 系统的构建与优化方法

• 了解知识产权格局与监管路径

• 认识基因编辑技术的伦理与安全问题

• 具备用 Agent 工作流独立完成育种项目方案设计的综合能力

详细介绍：

第一天课程内容

基因编辑工具介绍

正本清源：基因编辑和转基因

解析基因编辑与转基因的本质区别；SDN（Site-Directed Nuclease，定点核酸酶）1/2/3 三类划分；讨论中国、美国、日本、欧盟、英国的监管差异与全球产业化现状

案例：不褐变双孢蘑菇（PPO 敲除，美国首个豁免管制）；高油酸大豆 Calyno（FAD2，美国上市）；高 GABA 番茄（SlGAD3 截断自抑制域，日本上市）；中国 2023—2025 年主粮作物获证情况

不褐变双孢蘑菇

高油酸大豆

转基因与基因编辑的区别，以及SDN-1/2/3分类

基因编辑工具先驱—ZFNs 和 TALENs

早期基因编辑工具的设计原理、优缺点及历史贡献；TALE 骨架在细胞器编辑中至今不可替代

案例：TALEN 创制高油酸大豆——多拷贝作物必须同时编辑同源基因

CRISPR 系统家族介绍

从细菌免疫系统到基因编辑工具的演变；Class 1 与 Class 2 分类；Type II（Cas9）、Type V（Cas12）、Type VI（Cas13）效应蛋白概览

CRISPR-Cas9 的工作原理

sgRNA 与 DNA 结合机制、PAM 识别、R-loop 形成、HNH/RuvC 切割、双链断裂修复途径（NHEJ / HDR / MMEJ）

CRISPR-Cas9 工作原理

CRISPR-Cas9 介导基因敲除与敲入

通过 NHEJ 和 HDR 两种修复途径实现的不同编辑效果；植物中 HDR 效率极低是碱基编辑与引导编辑出现的动因

案例：香味水稻（OsBADH2 敲除，1—2 代替代 6—8 代回交）；抗稻瘟病水稻（OsERF922、Pi21——敲除感病基因是农业编辑最主流策略）

抗稻瘟病水稻

CRISPR-Cas12、13 的工作原理

Cas12a 的 T 富集 PAM、粘性末端与 crRNA array 自加工能力（天然适合多重编辑）；Cas13 的RNA 靶向编辑与诊断应用潜力（SHERLOCK / DETECTR）

案例：Cas12a 多靶点编辑水稻；Cas13 介导 RNA 病毒抗性

新型 CRISPR 系统

CasΦ（Cas12j）、小型 Cas 蛋白 CasMINI（Cas12f）；祖先系统 IscB、TnpB 与真核 Fanzor（约400 aa，适合病毒载体与 RNP 递送）

国产自主知识产权系统：Cas12i、Cas12Max、CyCas9 等——规避国外基础专利的主要路径

高保真 Cas9 变体与 PAM 拓展变体

高保真：SpCas9-HF1、eSpCas9(1.1)、HypaCas9、Sniper-Cas9、HiFi Cas9；效率与特异性的权衡PAM 拓展：xCas9、SpCas9-NG、SpG（NGN）、SpRY（近乎无 PAM 限制）——直接决定目标 SNP 能不能编

案例：用 SpRY 打开缺少 NGG PAM 的抗除草剂位点（ALS P197、W574），已在水稻、小麦、西瓜中创制抗性等位基因

Cas 工具箱一览：按PAM、体积与特点选型

大片段整合新范式

CAST（CRISPR 关联转座酶）、PASTE（PE + Bxb1 整合酶）、PrimeRoot（植物专用，>10 kb 精准定点插入）、Bridge RNA / IS110 桥式重组酶（首个双特异性向导分子，可在无 DSB、无同源臂条件下实现插入、切除与倒位）

案例：PrimeRoot 在水稻安全港位点定点插入 >10 kb 抗病基因表达盒，把"转基因"从随机插入变成定点可追溯

基因克隆相关技术简介

质粒设计、PCR、限制性酶切、连接、Golden Gate、Gibson 等基础技术；植物表达载体的特殊要素（作物适用启动子、密码子优化、NLS、筛选标记）

SnapGene 软件使用实操

质粒图谱设计、sgRNA 表达盒设计、引物设计、虚拟克隆与测序分析（ab1 套峰判读）

AI 工具模块一（入门）：AI 作为科研操作系统

三层工具地图：入门层（WorkBuddy 等本地执行型桌面 Agent）／进阶层（Claude Science、ClaudeCode、Codex）／专家层（AlphaFold 3、ESM3、Evo 2、BioNeMo）

面向实验科学家的提示词工程基础：给角色、给结构、给样例、分步执行、要求自查

实操：用 Agent 完成"目标性状 → 候选基因 → 已发表编辑案例"的结构化调研表，并逐条到数据库核对

幻觉识别与引用核查：基因名查数据库、效率数据回原文献、产业化状态查监管机构公开清单

第二天课程内容

CRISPR-Cas9 系统敲除载体构建实操

sgRNA 设计相关注意事项

PAM 位点选择、脱靶预测、GC 含量考量、二级结构避免、poly-T 规避、染色质可及性

辅助工具推荐：植物专用 CRISPR-P 2.0、CRISPR-GE、WheatCRISPR；通用 CHOPCHOP、CRISPOR、Benchling；深度学习预测 DeepCRISPR、DeepSpCas9、CRISPRon、DeepHF

AI 穿插：用 Claude Code / Codex 写脚本，对多倍体同源基因做多序列比对、枚举保守区 PAM、批量打分并输出候选表

SgRNA 设计八项检查清单（农业育种版）

常规的构建方案

从 oligo 合成、退火到完整载体的详细流程；Golden Gate（BsaI/BsmBI）与 Gibson 组装；常见问题解决（空载背景高、退火失败、测序套峰、编辑效率为零的排查顺序）

作物遗传转化与再生

农杆菌介导、基因枪、原生质体 PEG 转化、花粉管通道法等

提效策略：GRF4-GIF1 嵌合蛋白、发育调控因子 BBM/WUS2

无外源 DNA 编辑路线：RNP 递送、瞬时表达、病毒介导（VIGE）、单倍体诱导编辑（HI-Edit /IMGE）

案例：GRF4-GIF1 使小麦转化再生效率提升数倍并扩展可转化基因型；HI-Edit 在玉米中一步获得编辑纯合自交系

测序原理简介与测序数据分析

Sanger 测序 + 解卷积（TIDE、ICE、DSDecode）；高通量扩增子测序（Hi-TOM、CRISPResso2）；PCR-RE 快速筛选；脱靶检测（Cas-OFFinder、GUIDE-seq、全基因组重测序）

AI 穿插：用 Agent 搭建"fastq → CRISPResso2 批量分析 → 编辑效率热图与突变谱 → Excel 汇总"的自动化流程，并要求输出环境依赖清单以保证可复现

多基因编辑

多基因编辑原理

同时编辑多个基因的策略选择，提高编辑效率的方法；多重靶点设计与互相干扰避免策略（避免序列高度相似、避免靶点过近、注意 Cas 蛋白量竞争）

多基因编辑载体构建实操

多 sgRNA 串联策略：tRNA-gRNA 串联（PTG）、Csy4/核酶加工、Cas12a crRNA array（最简洁）多启动子设计策略与表达平衡考量：U3/U6 启动子活性差异，串联靠后的 sgRNA 表达偏低，把关键靶点放在前面

案例：番茄从头驯化（同时编辑 SP、SP5G、CLV3、GGP1、LYC 等 4—6 个基因，一步聚合多性状）；异源四倍体野生稻快速驯化；多重编辑创制耐盐水稻

CRISPRa/CRISPRi（基因激活与基因抑制）

dCas9 招募系统介绍

dCas9-VP64 / VPR / SAM 基因激活系统；dCas9-SRDX（植物专用抑制域）、dCas9-KRAB 基因抑制；SunTag / MoonTag 多拷贝激活域招募

育种价值：不改变基因序列而调控表达量，对剂量敏感型性状（株型、花期、产量组分）尤其有用

表观基因组编辑

dCas9-TET1（去甲基化）、dCas9-DRM/DNMT3A（定向甲基化）、CRISPRoff/CRISPRon 可遗传表观沉默与再激活；无 DNA 序列改变，监管上可能享有更宽松路径

顺式调控元件编辑：创造连续变异

敲除编码区产生"有/无"的极端表型，而育种需要"恰到好处"的中间表型。启动子平铺编辑可一次产生表达量梯度的等位基因系列供田间选择

案例：番茄 SlCLV3 启动子编辑创造果实大小连续变异；水稻 Wx 位点调控直链淀粉定制食味品质（已获中国安全证书）；玉米 ZmCLE7、水稻 OsSPL14 调控区微调避免全敲除的发育缺陷

基因编辑创造果实大小连续变异

第三天课程内容

CBE 系统的原理及其应用

CBE 系统进化过程总结

从 BE1 到最新 CBE 系统的演进历程与性能提升：BE1（概念验证）→ BE2（加 UGI）→ BE3（nCas9 切口酶）→ BE4max / AncBE4max（双 UGI + 表达优化）→ A3A-PBE（植物专用，可编辑高甲基化区）→ YE1/eA3A（窄窗口高特异性）

碱基编辑器结构、编辑窗口与旁观者效应

基因组 CBE 编辑（植物育种 / 基因功能研究 / 临床治疗）

案例：A3A-PBE 在小麦、水稻、马铃薯中高效 C→T 编辑（动物细胞里最好的工具不一定是植物里最好的）

案例：碱基编辑创制抗除草剂作物——水稻 OsALS（P171F/W548L）、小麦 TaALS（P174S，已获中国安全证书）、西瓜 ClALS、水稻 OsEPSPS

基因编辑创制抗除草剂水稻种质

细胞器 CBE 编辑工具介绍

线粒体/叶绿体编辑的特殊挑战（gRNA 无法进入细胞器）与解决方案：DdCBE（TALE + 分裂型DddA + UGI，C→T）、TALED（+ TadA8e，A→G）

案例：DdCBE 编辑生菜、油菜叶绿体基因组

CBE 系统的脱靶效应

sgRNA 依赖的 DNA 脱靶（可通过设计规避）、sgRNA 非依赖的随机 DNA 脱靶（只能换高保真脱氨酶）、RNA 脱靶（R33A/K34A 突变可显著降低）

新型 CBE 系统

各种改进版本对比与选择指南：按效率、窗口宽度、脱靶水平、序列偏好性选择

ABE 系统的原理及其应用

PACE 和 PANCE 人工定向蛋白进化系统介绍及其他常规蛋白进化技术

PACE（噬菌体辅助连续进化）、PANCE（非连续版本）、大肠杆菌正交进化系统；对照：易错PCR、饱和突变文库、理性与半理性设计

自然界不存在作用于 DNA 的腺嘌呤脱氨酶——TadA 的定向进化是"从无到有创造酶"的经典案例

ABE 系统的进化过程总结

ABE1.2 → ABE7.10（经典版本）→ ABE8e / ABE8.17-m（动力学速率提升约 590 倍，窗口更宽，植物中效率显著提高）→ ABE9 及窄窗口变体；TadA 衍生的 TadCBE、TadDE

ABE 系统的"另类"应用

ABE 系统如何实现 C 编辑、剪接位点调控（5′-GT / 3′-AG）、起始与终止密码子改造、uORF 编辑、miRNA 靶位点编辑等非常规功能

案例：编辑 SlGGP1 的 uORF 起始密码子提高番茄维生素 C（不动蛋白序列就调高蛋白量）；

ABE 编辑 OsSPL14/IPA1 改良株型；碱基编辑创制温敏雄性不育系（TMS5）

双碱基编辑系统

SWISS / STEME / A&C-BEmax / SPACE / ACBE

各种双碱基编辑系统的设计原理与适用场景；STEME 与 SWISS 是植物领域主力

双碱基编辑系统改造总结

窗口协同、脱氨酶配对、正交招募（SunTag + MS2/PP7）等改造思路

案例：STEME-NRCH 在水稻体内对 OsACC 做饱和突变定向进化

其他类型的碱基编辑系统

糖基化酶介导的碱基编辑

新型编辑机制与应用潜力：主动利用碱基切除修复（BER）而非抑制它

CGBE、AYBE、gGBE、TSBE

CGBE（C→G 颠换）、AYBE（A→C/T 颠换）、gGBE（工程化 MPG 糖基化酶提高颠换效率）、TSBE（序列 context 特异，降低旁观者效应）；配合引导编辑基本实现"任意碱基替换"

AI 工具模块二（进阶）：蛋白结构预测与序列大模型

AlphaFold 3 / Boltz-2 / OpenFold3：预测 Cas 蛋白–sgRNA–DNA 三元复合物，定位与 DNA 骨架接触的碱性残基，指导高保真变体与 PAM 拓展变体设计；预测脱氨酶–nCas9 连接肽以调整编辑窗口

实操：用 Claude Science 调用 BioNeMo 工具集跑一次结构预测与变异打分，产出图、代码与环境

绑定保存的可复现报告

第四天课程内容

报告系统

细胞实验结合流式分析

单荧光报告（移码恢复）、双荧光报告（mCherry-靶点-GFP，比值排除转化效率波动）、流式定量与阳性细胞分选

植物稳转的抗除草剂、显色等报告系统

ALS/EPSPS/BAR 抗性正筛选；花青素显色；PDS 敲除白化苗（最经典的肉眼可见阳性对照，建议所有新体系先打 PDS）

原生质体制备与应用实操

从"设计好载体"到"知道行不行"，稳转需 3—6 个月，原生质体只要 3—5 天；任何多方案比选都应先过原生质体

实操流程：材料准备 → 酶解（纤维素酶 R-10 + 离析酶 R-10）→ 过滤纯化与活性检测 →PEG-钙转化 → 暗培养收样 → 扩增子测序或流式分析

关键控制点：材料生理状态 > 酶解时间 > 渗透压 > PEG 批次；局限：只能横向比较，不能外推稳转绝对效率

细胞与基因编辑工具优化实操

编辑效率影响因素全清单

启动子选择（Ubi/Actin 驱动 Cas，OsU3/OsU6/TaU6 驱动 sgRNA）、密码子优化、内含子增强（IME）、双 NLS 配置、37 ℃ 短时热处理、靶点染色质状态、修复途径调控、组织与发育阶段

RNA 编辑系统

Cas13-ADAR（REPAIR / RESCUE）、内源 ADAR 招募（LEAPER / RESTORE）；不改变基因组的可逆调控，在作物中主要用于病毒抗性与瞬时性状调控

PE 系统的原理

Prime Editing 工作机制

nCas9(H840A) + 工程化逆转录酶 + pegRNA（spacer + 骨架 + PBS + RTT）；切口 → PBS 配对 →逆转录 → 3′/5′ flap 竞争 → 修复固定

PE2 / PE3 / PE3b / PE4 / PE5 的区别：nicking sgRNA 的引入与 MMR 抑制（MLH1dn）

引导编辑（Prime Editing）分子机制

编辑效率影响因素详解

PBS 长度（经验最优 Tm 约 30 ℃）、RTT 长度与编辑后同源臂、编辑位点到切口的距离、pegRNA 3′ 端稳定性（epegRNA 加 tevopreQ1 或 mpknot 假结）、MMR 活性、RT 与 nCas9 表达量

植物 PE 的专门优化

PPE（效率普遍 <3%）→ ePPE（去除逆转录酶 RNase H 结构域 + 病毒 RNA motif 保护 pegRNA3′ 端，水稻小麦中效率提升数倍）→ ePPEplus、PE6 系列

案例：ePPE 在水稻创制 OsALS、OsACC 抗除草剂等位基因（多碱基替换是 CBE/ABE 做不到的）。PE 的定位是"碱基编辑做不了的精准改变"，不要用 PE 做 CBE/ABE 能做的事

双 pegRNA 的原理及其应用（基因组大片段插入与删除）

双 pegRNA 策略

twinPE（片段替换，可结合 Bxb1 做大片段整合）、PRIME-Del（bp 级精度删除）、GRANDEditing（较大片段精准插入）

DualPE：植物双引导编辑

以 2×35S 与 EF1α 启动子驱动 ePPEplus，在本氏烟中实现最长 134.7 kb 删除、1.6 kb 删除 + 66bp 替换、20.1 kb 倒位；在番茄中实现 725 bp—10 kb 的删除、替换与倒位，效率最高达 72.7%

案例：定点大片段倒位/删除用于打破连锁累赘——优良基因常与不良基因紧密连锁，定点倒位可人为改变重组格局。这是"染色体工程"从设想走向可操作的转折点

基因组大片段插入

PrimeRoot、PASTE、CAST、Bridge RNA

PrimeRoot：PE 写入重组位点 + Cre/Bxb1 重组酶，在水稻玉米实现 >10 kb 精准插入；PASTE：attB + Bxb1，人类细胞 36 kb；CAST：Cas12k 引导 Tn7 转座子，无需 DSB 与 HDR

Bridge RNA / IS110 桥式重组酶：结构化非编码 RNA 的两个内部环分别与靶 DNA 和供体 DNA配对，两环独立可编程，单一机制实现插入、切除、倒位；后续工作已展示兆碱基级重排。植物应用尚属空白，是极具价值的前沿方向

应用场景清单：抗病基因簇整体导入、代谢通路模块导入、优良单倍型整体替换、制种体系元件定点整合

大片段精准操作技术对比

AI 工具模块三（进阶）：pegRNA 设计与实验数据分析 Agent

pegRNA 设计工具：PrimeDesign、PlantPegDesigner（植物专用）、pegFinder、PE-Designer；深度学习效率预测 PRIDICT/PRIDICT2.0、DeepPE、Easy-Prime（可对上千条候选排序，减少湿实验试错）

实操一：用 Codex / Claude Code 搭建"基因序列 + 目标编辑 → 可订购 pegRNA/nsgRNA oligo 清单"的小流水线，分步执行并逐步核对设计规则来源

第五天内容

PE 系统的优化案例

各领域 PE 优化成功案例分析：植物、人类细胞

植物路线针对"pegRNA 稳定性"瓶颈（ePPE 的改造逻辑）；人类细胞路线针对"修复途径竞争"瓶颈（PE4/PE5、PEmax、epegRNA）

特定应用场景的系统改造策略

按编辑类型（点突变／小片段插入删除／多碱基替换）、按作物（单子叶／双子叶）、按递送方式选择改造方向

PE 系统的构建实操

引物设计工具的应用

PrimeDesign 一键输出克隆 oligo；SnapGene 验证组装；Primer3/Primer-BLAST 设计鉴定与测序引物

载体构建实操：从基础载体到成熟系统的实验流程

单质粒 vs 双质粒共转的取舍；Golden Gate 一步组装 pegRNA 表达盒；模块化标准件便于快速换靶点

完整流程：原生质体快速比选 pegRNA → 最优组合稳转 → T0 测序筛选 → T1 分离无 T-DNA 纯合株 → 表型鉴定与脱靶评估

从编辑到品种：产业化路径

完整链条九阶段

靶基因确定（1—3 月）→ 编辑方案设计（1—2 月）→ 体系验证（1—2 月）→ 遗传转化与再生（4—12 月，最大瓶颈）→ 后代分离与纯合（1—2 个生长季）→ 分子检测（2—4 月）→ 田间表型鉴定（2—3 年）→ 安全评价与获证（1—2 年）→ 品种审定与制种（2—3 年）；合计约5—8 年，相比常规育种 8—12 年

AI 工具模块四（综合）：端到端 Agent 育种方案实战

结课实战：给定育种目标（耐盐碱水稻／抗赤霉病小麦／耐密植玉米／耐贮运番茄／高油酸油菜），用 Agent 工作流九步完成方案——文献与专利检索 → 候选基因排序 → 编辑策略选择 → 向导设计 → 载体方案 → 转化与再生方案 → 检测方案 → 时间表与预算 → 风险清单与备选方案

产出：8—12 页项目方案书 + 一页汇报 PPT。

AI 使用的边界：幻觉与四类必查信息（基因名、位点编号、文献 DOI、效率数值）；可复现性要求；未公开数据的合规处理；两用性与生物安全

伦理与安全

脱靶与非预期效应评估（全基因组测序、群体对照、多代稳定性）；非预期表型与基因多效性；生态风险（基因流、抗性演化、生物多样性）

往期学员反馈