Science Advances | 四川大学林宏辉/席德慧团队揭示转录因子TOE3同时促进烟草生长和抗病毒防御的新机制|互作|免疫|受体|四川大学|席德慧|抗病毒|林宏辉|磷酸化|野生型

近日，四川大学生命科学学院林宏辉教授/席德慧教授团队在Science Advances发表了题为A transcription factor TOE3 simultaneously promotes growth and antiviral immunity by disrupting ABA core module in tobacco的研究论文。植物免疫激活常伴随生长抑制，这一“生长-防御权衡”长期困扰作物育种。尽管此前该团队已发现AP2转录因子TOE3能同时促进烟草生长和抗病毒防御，但其背后的分子机制一直是个谜。在这项研究中，团队锁定TOE3蛋白的N端结构域（T3N），发现它能够结合ABA受体PYL4，干扰PYL4与PP2C4的结合——相当于在ABA信号通路的源头“拆掉”了一个核心组件。更巧妙的是，当TMV侵染时，T3N发生磷酸化修饰，与PYL4的结合力大幅增强，从而进一步放大对ABA信号的抑制效果。这一发现揭示了一个由TOE3介导的、通过“劫持”ABA核心模块来解偶联GDT的全新机制，为培育兼具强生长和高抗病毒能力的作物品种提供了新策略。

研究团队首先对野生型和NtTOE3敲除烟草的转录组数据进行分析，发现在NtTOE3敲除植株中下调表达的基因显著富集于“ABA激活信号通路”和“ABA刺激细胞应答”等条目。RT-qPCR验证显示，CR-TOE3植株中ABA响应基因的表达水平显著高于野生型。种子萌发实验进一步表明，NtTOE3过表达植株在含ABA的培养基上萌发率更高，而敲除植株则对ABA更加敏感。通过酵母双杂交、双分子荧光互补、分裂荧光素酶互补和体外pull-down等多种实验，团队证实TOE3的N端结构域（T3N）与ABA受体PYL4存在物理互作。在烟草和本氏烟中，T3N均能与PYL4结合并抑制ABA响应基因的表达。

图1：TOE3通过N端结构域与ABA受体PYL4互作并抑制ABA信号

为探究ABA信号在生长与抗病毒中的功能，团队用外源ABA处理烟草和本氏烟，发现植株鲜重和株高显著降低，TMV侵染后病毒外壳蛋白积累量大幅上升，病斑更严重。而用ABA合成抑制剂氟啶酮处理后，植株生长更旺盛，病毒积累显著减少。在此基础上，团队构建了NtT3N过表达烟草株系，发现T3N-OE植株在30天时鲜重和株高均显著高于野生型，TMV侵染后病毒积累量更低、病斑更轻。相比之下，CR-TOE3植株生长受抑且更感病。RT-qPCR显示，T3N-OE植株中ABA响应基因NtABF4和NtRAB18的表达被显著下调。

图2：T3N过表达抑制ABA信号从而促进烟草生长和抗病毒免疫

团队进一步构建了NtPYL4过表达和CRISPR-Cas9敲除的烟草株系。30天时PYL4-OE植株鲜重和株高显著低于野生型，而CR-PYL4植株则显著高于野生型。TMV侵染后，PYL4-OE植株病斑更重、病毒积累更多，CR-PYL4则相反。在本氏烟中沉默NbPYL4同样促进了生长并降低了病毒积累。遗传杂交实验表明，CR-PYL4 CR-TOE3双突变体的生长和抗病表型介于CR-PYL4和CR-TOE3之间，说明NtTOE3在NtPYL4上游发挥作用。

图3：PYL4过表达激活ABA响应并抑制烟草生长、促进病毒感染

鉴于PP2C4是ABA信号通路中受PYL调控的核心组分，团队检测了NtPYL4与NtPP2C4的互作。通过CRISPR-Cas9敲除NtPP2C4后发现，CR-PP2C4植株生长受抑且TMV感染后症状更严重。遗传分析显示，CR-PYL4 CR-PP2C4双突变体的生长和抗病表型与CR-PP2C4单突变体无显著差异，表明PP2C4在PYL4下游发挥作用。在本氏烟中，过表达NbPP2C4可降低病毒积累，而共表达NbPYL4则逆转了这一效应。基于T3N和PP2C4都能结合PYL4这一发现，团队假设T3N可能通过竞争性结合来干扰PYL4-PP2C4互作。分裂荧光素酶互补实验证实，T3N的加入显著降低了PYL4与PP2C4的结合信号。微量热泳动实验定量显示，T3N与PYL4的解离常数（Kd）约为3.5 nM，而PP2C4与PYL4在无ABA时的Kd约为1061.7 nM——T3N对PYL4的亲和力比PP2C4高出约300倍。在ABA存在下，50 nM T3N即可将PYL4-PP2C4的Kd从130.48 nM提升至505.82 nM，200 nM T3N则完全阻断二者互作。然而，在CR-PP2C4背景下过表达T3N并不能完全拯救突变体的生长和感病表型。

为检验磷酸化是否影响T3N与PYL4的结合，团队构建了磷酸化模拟突变体T3Nᴰᴰ和非磷酸化突变体T3Nᴬᴬ。分裂荧光素酶互补和体外pull-down实验均显示，T3Nᴰᴰ与PYL4的结合信号显著强于野生型T3N，而T3Nᴬᴬ的结合信号则明显减弱。在体内竞争中，T3Nᴰᴰ对PYL4-PP2C4互作的干扰效果最强。团队进一步构建了T3Nᴰᴰ-OE和T3Nᴬᴬ-OE烟草株系，发现T3Nᴰᴰ-OE植株生长更旺盛、病毒积累更少，而T3Nᴬᴬ-OE则与野生型无显著差异。