2026年8月12日，北京中医药大学王伟、王勇团队联合首都医科大学附属北京安贞医院仇琪团队、中国医学科学院北京协和医学院、北京同仁医院及中国中医科学院西苑医院等单位，在Circulation Research （中科院1区，TOP, IF=18.0）发表题为“Natural ERRα Activator Formononetin Ameliorates Anthracycline Cardiotoxicity via Metabolic Improvement”的原创研究论文。论文由Xiaoping Wang、Wei Wang、Qi Qiu和Yong Wang担任通讯作者。北京中医药大学官网可确认王伟、王勇的中文署名，首都医科大学官网确认Qi Qiu中文名为仇琪；Xiaoping Wang既往中文论文署名对应王小平。 论文于2026年5月22日投稿，7月25日修回，7月29日接收。
该研究聚焦蒽环类药物诱导的心脏毒性（anthracycline-induced cardiotoxicity，AIC）这一肿瘤治疗中的重要临床问题。研究首先在小型猪AIC模型和接受化疗的患者心脏组织中发现，雌激素相关受体α（estrogen-related receptor α，ERRα）在临床心功能异常出现之前即发生选择性下调；进一步通过心肌细胞特异性ERRα过表达和敲低模型证明，ERRα下降并非单纯伴随现象，而是推动心肌脂肪酸氧化障碍、线粒体能量代谢崩溃和心功能恶化的重要事件。
在此基础上，研究者从天然异黄酮类植物雌激素中筛选出刺芒柄花素（Formononetin），发现其能够选择性增强ERRα活性，促进脂肪酸氧化（FAO）和氧化磷酸化（OXPHOS），并在小鼠和小型猪AIC模型中改善心脏代谢及收缩功能。机制研究进一步显示，刺芒柄花素并非简单结合游离ERRα，而是高亲和力识别并稳定ERRα-PGC-1α复合物，增强ERRα在代谢基因启动子上的结合及转录活性。值得关注的是，在3例人乳腺癌患者来源类器官中，刺芒柄花素不仅未削弱多柔比星的抗肿瘤效应，还表现出进一步增强抑制肿瘤细胞增殖的潜力，为其在肿瘤心脏病学中的“双重作用”提供了实验依据。
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【摘 要】
背景：蒽环类药物诱导的心脏毒性（anthracycline-induced cardiotoxicity，AIC）限制了这类挽救生命的化疗药物在临床中的应用，其发生发展与早期心肌代谢重塑密切相关。核受体雌激素相关受体α（estrogen-related receptor α，ERRα）是心脏能量代谢的核心调节因子，但ERRα在AIC过程中何时发生下调、这种变化是否直接参与AIC发生，以及能否通过药物激活ERRα实现心脏保护，目前尚不明确。
方法：研究首先在小型猪AIC模型中对ERRα蛋白进行时间序列分析。随后利用心肌细胞特异性ERRα功能获得和功能缺失小鼠模型，评价ERRα在AIC中的因果作用。机制研究结合染色质免疫沉淀-qPCR（ChIP-qPCR）、报告基因实验和微尺度热泳动（microscale thermophoresis，MST）等方法，研究天然化合物刺芒柄花素的作用机制。同时采用人乳腺癌患者来源类器官（patient-derived organoids，PDOs）评价刺芒柄花素是否影响抗肿瘤活性。
结果：ERRα在AIC小型猪心脏以及接受化疗患者的心脏组织中均出现选择性下调。小型猪时间序列分析显示，ERRα水平在亚临床阶段，即第6周时已经下降，早于明确的心功能障碍出现。心肌细胞特异性过表达ERRα能够激活线粒体代谢相关基因程序、增强脂肪酸氧化并维持多柔比星处理后的收缩功能；相反，敲低ERRα则进一步加重生物能量障碍和心功能异常。
药物筛选进一步鉴定出刺芒柄花素是一种效力较强且具有选择性的ERRα激活剂。刺芒柄花素可增强ERRα转录活性、改善线粒体代谢，并在小鼠和小型猪AIC模型中发挥心脏保护作用。
机制上，ChIP-qPCR显示刺芒柄花素可增加ERRα在靶基因启动子区域的富集，而MST证实刺芒柄花素能够直接结合ERRα/PGC-1α复合物，提示其可能通过变构稳定这一复合物增强ERRα活性。
此外，在人乳腺癌患者来源类器官中，刺芒柄花素单独处理即可降低类器官活力和增殖，与多柔比星联合后还可进一步增强抗肿瘤效应。
结论：ERRα下调是AIC发生发展过程中的一个早期且具有因果作用的事件。刺芒柄花素可作为一种新型选择性ERRα激活剂，通过改善心肌代谢和心脏功能发挥保护作用，同时保留甚至可能增强抗肿瘤活性，提示其具有作为蒽环类化疗期间双重作用心脏保护候选药物的潜力。
01
研究背景及科学问题
蒽环类化疗药物，尤其是多柔比星（doxorubicin，Dox），已经广泛应用于淋巴瘤、白血病和乳腺癌等多种恶性肿瘤治疗超过50年。然而，在发挥明确抗肿瘤作用的同时，多柔比星也具有显著的心脏毒性，可能导致左心室（left ventricular，LV）功能下降甚至心力衰竭（heart failure，HF）。
目前，临床主要沿用β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂等标准心衰药物处理AIC，但其疗效有限，仅部分患者能够获得一定程度的心功能恢复。右雷佐生虽然在部分AIC患者中具有保护作用，但针对AIC发生机制开展精准预防和干预的治疗策略仍十分有限。因此，进一步解析蒽环类心脏毒性的关键分子机制具有重要意义。
病理性代谢重编程是AIC的重要特征之一，其表现为心肌底物利用逐渐受损以及线粒体功能障碍。心脏持续收缩具有极高的能量需求，正常情况下高度依赖稳定的线粒体氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）提供ATP，而蒽环类药物可显著破坏这一过程。
更值得关注的是，代谢重塑和线粒体损伤往往早于明确的心功能下降出现，并可能直接推动心脏功能恶化。因此，调控心肌能量代谢的关键分子可能成为AIC干预的重要靶点。
雌激素相关受体（estrogen-related receptors，ERRs）是一类在高能量需求组织中调控能量代谢的重要核受体。在心脏中，ERRα可控制脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，FAO）、OXPHOS及线粒体功能相关基因的转录。
已有研究提示ERRα与心力衰竭及压力超负荷后的心脏代谢适应有关。与此不同，尽管ERRγ与ERRα具有部分共同的靶基因，ERRγ还能够通过GATA4信号促进心肌肥厚，因此可能对舒张功能产生不利影响。这意味着，在AIC治疗中，相比非选择性激活ERR家族，寻找能够选择性激活ERRα的药物可能更具价值。
尽管近期多组学研究已经观察到AIC与ERRα表达下降之间的联系，但至少仍存在三个关键问题尚未解决。
首先，ERRα抑制与心肌细胞损伤之间的时间关系和细胞特异性关系尚不明确；其次，目前缺乏直接因果证据证明ERRα下调会驱动心肌代谢障碍和心肌损伤；第三，尚不清楚是否存在具有良好药理可用性的分子，可以通过激活ERRα保护心脏免受AIC损伤。
基于此，本研究首先在具有较高转化价值的小型猪AIC模型及患者心脏组织中评估ERRα变化，随后利用心肌细胞特异性的ERRα过表达和敲低模型明确其因果作用。在此基础上，研究进一步筛选天然异黄酮类化合物，并最终鉴定出刺芒柄花素作为选择性ERRα激活剂，系统验证其在小鼠、小型猪及人乳腺癌患者来源类器官中的作用，并深入解析其与ERRα-PGC-1α复合物之间的分子机制。
02
重要发现及亮点
ERRα在AIC早期即发生选择性下调，并伴随心肌能量代谢障碍
研究首先利用既往建立的小型猪AIC模型，对疾病发展的时间过程进行分析。动物接受5次、每两周1次的冠状动脉内多柔比星给药，随后继续观察2周。
在第6周时，小型猪已出现T2弛豫时间延长，但原生T1值、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）和短轴缩短率（fractional shortening，FS）尚未出现明显改变。这一阶段代表亚临床、仍具有可逆性的心肌损伤。
值得注意的是，在这一尚未出现明确心功能异常的阶段，心肌靶向脂质组学已经显示中链及长链酰基肉碱明显降低，提示心肌脂肪酸利用可能已经受到影响。
至第10周，小型猪已出现明确心功能障碍，表现为T1和T2弛豫时间明显延长，LVEF和FS下降，血清N末端B型利钠肽原（NT-proBNP）及心肌肌钙蛋白T（cTnT）升高。
病理学显示，心肌结构紊乱、心肌细胞内大量空泡形成、细胞外纤维化以及细胞凋亡增加。电子显微镜进一步显示线粒体肿胀和嵴结构破坏，同时心肌细胞内出现明显脂滴沉积。
RNA测序结果进一步表明，AIC小型猪心脏中FAO、OXPHOS等多条线粒体能量转导通路相关基因整体下调。RT-qPCR进一步验证，10个FAO相关基因中有9个显著下调，而检测的OXPHOS相关基因也呈显著下降，支持心肌氧化代谢障碍是慢性AIC的重要病理特征。
进一步分析ERR家族发现，只有编码ERRα的Esrra与氧化代谢基因同步下降，而ERRγ并未发生类似变化。AIC小型猪心脏中总ERRα和核内ERRα蛋白均显著下降。
时间序列分析显示，ERRα在多柔比星处理后第2周和第4周基本不变，第6周开始下降，并在第10周进一步明显降低；相比之下，ERRγ在整个过程中均未显著改变。这提示ERRα下调与亚临床代谢重塑同步发生，而并非终末心衰的非特异性继发现象。
研究进一步分析了5例接受化疗并出现左心室功能障碍患者以及5例健康供体的心脏组织。结果显示，化疗患者心脏中的总ERRα和核内ERRα蛋白均显著降低；免疫荧光共染还显示ERRα主要定位于心肌细胞，且化疗患者心脏中的ERRα信号明显减弱。由于人组织样本量较小，作者将其视为初步支持性证据。
图1：AIC中ERRα表达下降并伴随心脏能量代谢缺陷。（A、B）动物接受5次、每两周1次的冠状动脉内（IC）多柔比星（Dox）给药，随后经历2周无给药观察期。（C）Dox处理小型猪在第0、6和10周的T2和T1弛豫时间，每组n=6个独立生物学重复；数据以个体数值表示，并用连线连接同一动物的不同时间点。（D）采用M型超声心动图连续检测Dox处理小型猪在第0、2、4、6和10周的LVEF和FS，每组n=6个独立生物学重复；每个指标均显示个体数据，并以连线连接同一动物不同时间点。（E）Control组和Dox组LVEF及FS的组间比较，每组n=6个独立生物学重复，数据以组均值±SD表示。（F）左心室壁代表性电子显微镜图像，比例尺=1.0 μm；油红O染色图像，比例尺=50 μm。Control组n=3，Dox组n=6个独立生物学重复，并对受损线粒体和油红O阳性面积进行定量。（G）与Control组相比，基于Dox组心室中下调转录本进行GO Biological Process富集分析；Control组n=3，Dox组n=5个独立生物学重复。（H）采用RT-qPCR检测Control组和Dox组小型猪心室中编码FAO和OXPHOS相关基因的mRNA水平；Control组n=3，Dox组n=5个独立生物学重复。（I）热图显示编码ERR家族代谢相关转录本标准化mRNA水平的z-score，每组n=3个独立生物学重复。（J）采用RT-qPCR检测编码ERR家族成员的mRNA水平；Control组n=3，Dox组n=5个独立生物学重复。（K）总ERRα和核内ERRα的代表性Western blot图像，每组n=3个独立生物学重复；每孔分别上样总蛋白30 μg和核蛋白25 μg，GAPDH和组蛋白H3分别作为总蛋白和核蛋白内参。所有数据均以均值±SD表示，图中给出精确P值，P<0.0001以科学计数法显示。C、D采用Friedman检验并进行Dunn多重比较；E采用ART ANOVA评估组别、时间及二者交互作用，各时间点组间事后比较采用Wilcoxon秩和检验（Mann-Whitney U检验）并进行Bonferroni校正；F、K采用双侧精确Mann-Whitney U检验；G采用超几何检验并进行Benjamini-Hochberg FDR校正，富集GO条目以−log10(P值)表示；H中各基因采用Mann-Whitney U检验，并利用Benjamini-Krieger-Yekutieli两阶段FDR方法进行多重检验校正，报告FDR校正后的q值；J中各基因采用Mann-Whitney U检验，由于属于针对3个预设候选基因的靶向验证且比较数量有限，因此未进行多重检验校正。H和J中的数值以GAPDH归一化；K中的总蛋白以GAPDH、核蛋白以组蛋白H3归一化，并以相应对照组设为1计算倍数变化。
心肌细胞特异性过表达ERRα改善多柔比星诱导的心脏代谢和收缩功能
为验证ERRα升高是否能够直接保护心脏，研究采用AAV9-cTnT-ERRα在小鼠心肌细胞中特异性过表达ERRα。AAV在多柔比星处理前3周注射，随后小鼠接受4周多柔比星处理。
AAV9-cTnT-ERRα使心脏ERRα表达提高约1.64倍，并有效逆转多柔比星造成的ERRα下降。接受多柔比星后，ERRα过表达小鼠的LVEF和LVFS均显著高于对照AAV组，同时心肌组织结构得到更好保留。
ERRα过表达还减轻了多柔比星诱导的线粒体损伤和心肌细胞脂滴蓄积，并降低心脏及血清中的脂肪酸和甘油三酯水平。
与此同时，ERRα过表达提高FAO和OXPHOS相关基因表达，并增强原代心肌细胞的总脂肪酸氧化能力，表现为氧耗率（oxygen consumption rate，OCR）升高，同时BODIPY染色显示脂滴减少。
研究还比较了ERRα和ERRγ过表达的作用。尽管两者具有部分共同代谢靶基因，ERRγ过表达却诱导GATA4相关心肌肥厚程序，并在多柔比星应激下进一步加重心肌肥厚、胶原增生和收缩功能障碍；相比之下，ERRα并未诱导上述肥厚基因程序。这一结果进一步提示AIC干预应强调ERRα选择性，而非非选择性激活整个ERR家族。
图2：心脏特异性ERRα过表达对AIC进展的影响。（A）小鼠实验流程图：C57BL/6J小鼠静脉注射AAV9-cTnT-EGFP或AAV9-cTnT-ERRα-EGFP载体，随后连续4周每周静脉注射Dox，总累积剂量20 mg/kg。（B）采用RT-qPCR检测各组心脏Esrra表达，每组n=5个独立生物学重复，每个样本进行3个技术重复。（C）Western blot检测ERRα蛋白，每组n=6个独立生物学重复，每孔上样30 μg蛋白，GAPDH作为内参。（D）超声心动图评价心功能；H&E染色评价组织学，比例尺=40 μm；电子显微镜评价线粒体，红色箭头表示脂滴，比例尺=1.0 μm；左心室壁油红O染色比例尺=50 μm，每组n=5–8个独立生物学重复；并定量射血分数、受损线粒体比例（嵴缺失线粒体百分比）及油红O阳性面积。（E）采用ELISA检测心脏组织和血清中脂肪酸（FA）及甘油三酯（TG）含量，每组n=8个独立生物学重复，每个样本3个技术重复。（F）采用RT-qPCR检测心室FAO和OXPHOS相关mRNA，每组n=4个独立生物学重复，每个样本3个技术重复。（G）Western blot检测OXPHOS蛋白，每组n=4个独立生物学重复，每孔上样30 μg，GAPDH作为内参。（H）左：分离原代心肌细胞，先以CPT1B抑制剂Etomoxir 100 μmol/L预处理15分钟，随后在0分钟加入150 μmol/L棕榈酸，检测OCR相关FAO；右：定量基础状态及FCCP诱导最大应激状态下的总FAO，包括内源性和外源性FAO；每组n=6个独立生物学重复，每个样本3个技术重复。（I）采用BODIPY493/503染色显示分离原代心肌细胞内脂滴，每组n=6个独立生物学重复；每个重复定量15个心肌细胞并取平均值作为每只动物的一个数据点。所有数据以均值±SD表示，图中给出精确P值，P<0.0001以科学计数法表示。B–G及I采用ART ANOVA评价AAV基因型、多柔比星处理及二者交互作用，事后两两比较采用Wilcoxon秩和检验并进行Bonferroni校正；H采用双侧精确Mann-Whitney U检验。B、C、F和G均以GAPDH归一化，并以相应对照组设为1计算倍数变化。
心肌细胞ERRα缺失进一步加重AIC中的代谢崩溃和线粒体损伤
为了从反方向验证ERRα的因果作用，研究者在ERRα^flox/flox小鼠中利用AAV9-cTnT-Cre建立心肌细胞特异性ERRα敲低模型。
AAV9-cTnT-Cre使分离心肌细胞中的ERRα蛋白降低62.6%，但并未影响非心肌细胞ERRα，证实敲低具有心肌细胞特异性。在未接受多柔比星时，ERRα敲低本身并不会引起明显心功能异常或组织学损伤，也不会诱导ERRγ代偿性升高。
然而，在多柔比星应激下，ERRα敲低小鼠表现出更严重的心功能障碍，包括LVEF和LVFS进一步下降、左心室舒张末期内径（LVEDD）升高，同时Nppa和Nppb等胎儿型心脏基因表达上升。
此外，ERRα敲低进一步增加心脏FA和TG含量、线粒体嵴破坏及脂滴蓄积；分离原代心肌细胞的总FAO进一步下降，OXPHOS相关基因表达也同步减少。这些结果从功能缺失角度进一步证实，ERRα对于维持AIC条件下的心肌脂质代谢和线粒体功能具有重要作用。
图3：心脏ERRα缺失对多柔比星诱导线粒体表型的影响。（A）小鼠实验示意图：ERRα^flox/flox小鼠静脉注射AAV9-cTnT-Luc（同窝对照）或AAV9-cTnT-Cre，随后连续4周每周静脉注射Dox，总累积剂量20 mg/kg。（B）Western blot检测AAV-Luc和AAV-Cre小鼠心脏组织ERRα蛋白，每组n=4个独立生物学重复。（C）检测AAV-Luc及AAV-Cre小鼠分离心肌细胞和非心肌细胞中的ERRα蛋白，每组n=4。（D）检测接受载体或Dox处理的AAV-Luc和AAV-Cre小鼠分离心肌细胞ERRα蛋白，每组n=4；B–D每孔均上样30 μg蛋白，GAPDH作为内参。（E）代表性H&E图像，每组n=6，比例尺=40 μm。（F）代表性超声心动图；（G）EF、FS和LVEDD等超声心动图参数定量，每组n=6。（H）采用RT-qPCR检测Nppa、Nppb mRNA，每组n=3，每个样本3个技术重复。（I）采用ELISA检测心脏组织FA和TG，每组n=6，每个样本3个技术重复。（J）电子显微镜观察心脏组织脂滴和受损线粒体，比例尺=1 μm；（K）BODIPY493/503染色观察分离原代心肌细胞脂滴，比例尺=50 μm；每组n=6，每个生物学重复定量15个心肌细胞并取平均值作为每只动物的数据点。（L）原代心肌细胞以Etomoxir 100 μmol/L预处理15分钟后加入150 μmol/L棕榈酸，检测OCR相关FAO；并定量基础状态及FCCP诱导最大应激条件下内源性+外源性总FAO，每组n=6，每个样本3个技术重复。（M）采用RT-qPCR检测心室OXPHOS相关mRNA，每组n=3，每个样本3个技术重复。所有数据以均值±SD表示，图中提供精确P值，P<0.0001采用科学计数法。B、C及I–L采用双侧精确Mann-Whitney U检验；D、G、H采用ART ANOVA评价AAV基因型、多柔比星及交互作用，事后比较采用Wilcoxon秩和检验并进行Bonferroni校正；M中各基因采用Mann-Whitney U检验，并使用Benjamini-Krieger-Yekutieli两阶段FDR方法进行多重检验校正，报告FDR校正q值。B–D及M均以GAPDH归一化，并相对于指定对照组设为1。
天然异黄酮筛选锁定刺芒柄花素，并在乳腺癌类器官中保留抗肿瘤作用
确认ERRα具有心脏保护作用后，研究者进一步围绕线粒体保护开展天然异黄酮类化合物筛选。
研究以11种异黄酮类植物雌激素、10 μmol/L浓度分别处理多柔比星损伤的心肌细胞，并同时评价细胞活力、ATP含量、Annexin V凋亡和线粒体膜电位4项指标，采用0～4分的综合评分进行排名。最终，刺芒柄花素在候选化合物中排名最高。
为了排除心脏保护药物可能削弱化疗抗肿瘤作用的风险，研究采用3例新鲜乳腺癌组织建立患者来源类器官，分别包括ER+/PR+/HER2+、ER+/PR+/HER2−以及三阴性乳腺癌。
刺芒柄花素10 μmol/L单独处理即可显著降低3种PDO的直径、细胞活力和EdU阳性细胞比例。在Bliss独立模型分析中，刺芒柄花素与多柔比星联用在ER+/PR+/HER2−类器官和三阴性类器官中表现出显著协同抗增殖作用；在ER+/PR+/HER2+类器官中也观察到相同方向趋势，但未达到统计学显著性。
因此，在这些人乳腺癌类器官模型中，刺芒柄花素并未削弱多柔比星的抗肿瘤作用，反而显示进一步增强抗肿瘤效应的可能。
小鼠剂量探索进一步发现，50 mg/kg刺芒柄花素在改善心功能方面表现最佳，可提高LVEF和LVFS，降低LVEDD和LVESD，同时减少心肌纤维溶解、降低心肌FA水平、促进ATP产生，并上调心脏ERRα表达，但不激活ERRγ。
AC16人心肌细胞RNA-seq进一步显示，刺芒柄花素处理6小时和24小时后均持续富集OXPHOS基因程序，并显著上调ESRRA，而其他多数核受体通路未发生显著改变，支持其对ERRα相关代谢程序具有较强选择性。
刺芒柄花素在AIC小型猪模型中恢复ERRα和线粒体代谢
研究随后将刺芒柄花素的作用从小鼠进一步验证至大动物模型。
与预防性干预不同，小型猪实验是在多柔比星处理后第10周已经形成心功能障碍之后，才开始给予刺芒柄花素，并持续治疗4周，因此更接近治疗性干预场景。
治疗后，AIC小型猪EF和FS升高，LVEDD和LVESD下降，同时T2弛豫时间缩短，提示心肌水肿减轻。组织学进一步显示，刺芒柄花素减轻心肌局灶性溶解、细胞凋亡以及活性氧（ROS）产生，并恢复总ERRα和核内ERRα表达。
RNA-seq共筛得2856个与多柔比星损伤及刺芒柄花素逆转相关的差异表达基因。GSEA显示FAO和OXPHOS通路均受到显著激活。
ChIP-qPCR进一步证实，多柔比星降低ERRα在ACADM、NDUFS8、ATP5F1B和SDHD启动子区域的结合，而刺芒柄花素能够恢复这种启动子占据。因此，大动物结果进一步支持刺芒柄花素通过增强ERRα相关线粒体代谢程序改善AIC。
图4：刺芒柄花素在小型猪AIC模型中的治疗作用。（A）小型猪实验流程图：动物接受5次、每两周1次的冠状动脉内Dox给药，之后2周不再给药，再接受4周刺芒柄花素（For）治疗。（B）左：第14周Control、Dox、Dox+For和Dox+Dex组LVEF和FS的组均值±SD，每组n=3个独立生物学重复；右：3只Dox+For小型猪分别在基线、多柔比星处理结束后第10周（治疗前）和刺芒柄花素治疗4周后的第14周所测LVEF和FS个体变化轨迹，每条彩色线代表1只小型猪。（C）左：第14周各组T2弛豫时间组均值±SD，每组n=3；右：3只小型猪在第10周治疗前与第14周治疗后的个体T2变化，每条线代表1只动物。（D）左心室壁H&E染色代表图，比例尺=200 μm；TUNEL图像比例尺=100 μm；DHE图像比例尺=40 μm，每组n=3。（E）总ERRα和核内ERRα代表性Western blot，每组n=3；总蛋白上样30 μg，核蛋白上样25 μg；GAPDH和组蛋白H3分别作为总蛋白和核蛋白内参。（F）Venn图显示两组差异表达基因分析的交集。（G）线粒体代谢相关显著GSEA结果，每组n=3。（H）热图显示编码OXPHOS、FAO和三羧酸循环（TCA）代谢转录本标准化mRNA水平的Z-score，每组n=3。（I）在Control、Dox和Dox+For小型猪左心室组织中进行ChIP-qPCR，检测ERRα在ACADM、NDUFS8、ATP5B和SDHD启动子上的富集，每组n=3，每个样本3个技术重复，IgG为阴性对照。所有数据以均值±SD表示，图中提供精确P值，低于0.0001者采用科学计数法。B左、C左、D、E和I采用Kruskal-Wallis检验并进行Dunn多重比较；B右和C右采用Friedman检验并进行Dunn多重比较。E中的总蛋白以GAPDH、核蛋白以组蛋白H3归一化，并相对指定对照组设为1；I以% input表示，相对变化以相应对照组设为1进行归一化。
ERRα敲低显著削弱刺芒柄花素的心脏代谢保护作用
为了判断刺芒柄花素的心脏保护作用在多大程度上依赖ERRα，研究在ERRα^fl/fl小鼠中采用AAV9-cTnT-Cre建立心肌细胞ERRα敲低模型。
AAV9-cTnT-Cre使心肌细胞ERRα蛋白降低约69.9%，仍保留约30.1%。无论是否接受多柔比星，刺芒柄花素仍能够使残余ERRα的mRNA和蛋白表达升高，这与ERRα自身具有正反馈调控作用相一致。
在ERRα完整的对照小鼠中，刺芒柄花素显著改善LVEF、LVFS和心肌结构，并降低ROS产生。ERRα敲低后，刺芒柄花素仍保留一定保护作用，但整体效应明显减弱。
在代谢层面，刺芒柄花素可明显减少正常ERRα背景下的FA、TG积聚和线粒体损伤；ERRα敲低后，这些效应仍部分存在，但幅度降低。更关键的是，在ERRα敲低的原代心肌细胞中，刺芒柄花素已经无法显著减少脂滴蓄积，也无法恢复总FAO。
定量分析显示，刺芒柄花素对不同表型的ERRα依赖程度并不完全相同：LVEF约31.1%、LVFS约34.8%、LVEDD约41.2%、ROS约47.1%、FA约60.0%、TG约38.7%，线粒体嵴损伤约39.5%。
因此，刺芒柄花素的心脏保护和代谢改善作用部分但并非完全依赖ERRα。其中，脂肪酸代谢，特别是脂滴积聚和FAO，对ERRα的依赖尤为明显。
图5：体内ERRα敲低削弱刺芒柄花素对AIC的保护作用。（A）小鼠实验示意图：ERRα^flox/flox小鼠接受AAV9-cTnT-Luc或AAV9-cTnT-Cre静脉注射，随后接受Dox处理，再给予4周刺芒柄花素治疗。（B）采用RT-qPCR检测各组分离心肌细胞中的Esrra表达，每组n=5个独立生物学重复，每个样本3个技术重复；并进行（C）免疫荧光检测。（D）超声心动图统计结果，每组n=6。（E）DHE染色统计结果，每组n=6。（F）代表性超声心动图、左心室壁H&E染色图和DHE图，H&E和DHE比例尺均=20 μm，每组n=6。（G）采用ELISA检测心脏组织中的FA和TG，每组n=6，每个样本3个技术重复。（H）采用电子显微镜观察并定量心脏脂滴和受损线粒体，每组n=6，比例尺=1 μm。（I）分离原代心肌细胞以CPT1B抑制剂Etomoxir 100 μmol/L预处理15分钟，随后加入150 μmol/L棕榈酸，检测OCR相关FAO。（J）定量基础状态和FCCP诱导最大应激状态下内源性+外源性总FAO，每组n=6，每个样本3个技术重复。所有数据以均值±SD表示，图中提供精确P值，P<0.0001采用科学计数法表示。B采用Kruskal-Wallis检验并进行Dunn多重比较；D、E、G和H采用ART ANOVA评价AAV基因型、刺芒柄花素处理及二者交互作用，事后两两比较采用Wilcoxon秩和检验并进行Bonferroni校正；J采用双侧精确Mann-Whitney U检验。B中的数值以GAPDH归一化，并相对于指定对照组设为1。
体外实验进一步证实ERRα是刺芒柄花素改善心肌线粒体代谢的重要介质
研究随后在H9c2心肌细胞中利用shRNA敲低ERRα。ERRα蛋白降低约56%，残余约44%。
单独敲低ERRα即可导致线粒体代谢受损，表现为细胞ATP下降、最大OCR降低，以及FAO和OXPHOS相关基因表达减少，进一步支持ERRα在维持心肌能量稳态中的关键作用。
在正常对照细胞中，刺芒柄花素10 μmol/L可上调ERRα蛋白，增加ATP和OCR，并提高FAO及OXPHOS基因表达。
即便ERRα被部分敲低，刺芒柄花素仍可上调剩余ERRα并促进其核转位，同时一定程度恢复ATP、OCR和线粒体代谢基因表达。不过，不同指标对ERRα的依赖程度差异较大，其中Sdhb和Ndufb8等线粒体基因对ERRα依赖更明显。
此外，刺芒柄花素还能部分逆转ERRα敲低诱导的线粒体膜电位下降、心肌细胞凋亡和线粒体ROS积聚。总体而言，这些体外数据再次证明，ERRα是刺芒柄花素产生代谢保护作用的重要介质，但并非其唯一作用通路。
图6：ERRα介导刺芒柄花素的心脏保护作用。（A）Western blot检测H9c2细胞中总ERRα和核内ERRα，每组n=6个独立生物学重复；总蛋白和核蛋白均上样25 μg，GAPDH和组蛋白H3分别作为总蛋白和核蛋白内参。（B）采用ELISA检测细胞ATP，每组n=6，每个样本3个技术重复。（C）采用Seahorse XFe24分析仪检测H9c2细胞OCR，每组n=6，每个样本3个技术重复。（D）采用RT-qPCR检测H9c2细胞FAO和OXPHOS相关mRNA，每组n=3，每个样本3个技术重复。（E、F）Western blot检测H9c2细胞OXPHOS相关蛋白，每组n=5；E每孔上样30 μg蛋白，GAPDH作为内参。（G）使用JC-1荧光染料经流式细胞术检测线粒体膜电位（MMP），每组n=3，每个样本3个技术重复；红/绿荧光比值即聚集体/单体比值用于定量MMP；线粒体解偶联剂CCCP作为阳性对照；门控依据未处理细胞和CCCP阳性对照设定。（H）采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测凋亡率（Q2+Q4），每组n=5，每个样本3个技术重复；象限门依据未染色、Annexin V-FITC单染和PI单染对照建立。（I）采用MitoSOX和MitoTracker共染检测H9c2线粒体ROS，每组n=3；每个重复定量6个视野，每个视野约10个细胞，并取平均值作为一个生物学重复数据点。所有数据以均值±SD表示，图中提供精确P值，P<0.0001以科学计数法表示。A、B、F–I采用ART ANOVA评价shRNA、刺芒柄花素处理及交互作用，事后两两比较采用Wilcoxon秩和检验并进行Bonferroni校正。D和E中的数值以GAPDH归一化；A中的总蛋白以GAPDH、核蛋白以组蛋白H3归一化，并以相应对照组设为1表示倍数变化。
刺芒柄花素通过稳定ERRα-PGC-1α复合物增强ERRα转录活性
为了进一步解析刺芒柄花素如何增强ERRα活性，研究者首先在AC16人心肌细胞中进行ChIP-qPCR。
刺芒柄花素10 μmol/L处理24小时后，ERRα在ACADM、NDUFS8、SDHD、ATP5F1B及ACSL1等经典代谢靶基因启动子区域的富集明显增加，而IgG阴性对照未出现类似信号。
进一步的报告基因实验显示，刺芒柄花素显著激活ATP5B和ACADM野生型启动子；删除ERRα反应元件（ERRα-responsive element，ERRE）后，刺芒柄花素诱导的启动子活性升高明显消失，说明完整ERRE是其发挥转录调节作用的必要条件。
值得注意的是，表面等离子体共振实验并未检测到刺芒柄花素与游离ERRα蛋白直接结合；其与单独ERRγ的结合也极弱。
研究因此转向ERRα的重要共激活因子PGC-1α。MST结果显示，刺芒柄花素可与预先形成的ERRα-PGC-1α复合物高亲和力结合，表观解离常数Kd约为204 nmol/L，而其与ERRγ-PGC-1α复合物的结合明显弱得多，Kd约46.9 μmol/L。
AC16细胞原位邻近连接分析（PLA）也显示，刺芒柄花素能够显著增加内源性ERRα与PGC-1α之间的邻近信号。
进一步研究发现，敲低PGC-1α后，刺芒柄花素促进ERRα转录活性的效应完全消失；而过表达PGC-1α已使基础转录活性高度激活，此时再加入刺芒柄花素无法进一步增强信号。这表明刺芒柄花素的ERRα激活作用依赖PGC-1α，并且更可能通过稳定已有的ERRα-PGC-1α复合物发挥作用。
分子对接进一步预测刺芒柄花素能够稳定进入ERRα-PGC-1α复合物结合区域，对接评分为−3.818，MM-GBSA结合自由能为−31.37 kcal/mol，并提示GLN262可能是关键残基。
将GLN262突变为Q262A后，刺芒柄花素与ERRα-PGC-1α复合物的结合明显减弱，Kd升至约8.64 μmol/L，同时刺芒柄花素对ATP5B和ACADM启动子的激活作用消失。
100 ns分子动力学模拟还显示，刺芒柄花素结合后，ERRα-PGC-1α复合物更快达到构象稳定，并表现出结构刚性增强。综合以上结果，作者提出刺芒柄花素可能作为ERRα-PGC-1α复合物的变构稳定剂，增强其构象完整性和转录活性。
图7：刺芒柄花素通过ERRα-PGC-1α复合物增强ERRα转录活性。（A）AC16细胞经载体或刺芒柄花素（For，10 μmol/L，24小时）处理后，采用ERRα或IgG抗体进行ChIP-qPCR，每组n=3个独立生物学重复，每个样本3个技术重复；相应基因启动子富集以% input表示。（B）293T细胞共转染野生型或删除ERRE（ERREΔ）的ATP5B或ACADM启动子-荧光素酶载体和ERRα表达载体，随后给予载体或For 10 μmol/L处理24小时；以Renilla荧光素酶校正转染效率后计算相对荧光素酶活性，并以WT+Veh组作为1表示倍数变化，每组n=6。（C）采用MST检测For与预组装ERRα-PGC-1α复合物的结合。（D）PLA检测For诱导的ERRα-PGC-1α相互作用，红色点表示邻近信号，每组n=3，每个重复分析10个细胞，比例尺=20 μm。（E）293T细胞转染含ERRE的ATP5B-Luc报告载体，并分别进行PGC-1α敲低（左，si-PGC-1α）或过表达（右，PGC-1α OE）；给予Veh或For 10 μmol/L处理24小时；荧光素酶活性分别相对于si-NC/Veh或Empty Vector/Veh计算倍数变化，每组n=6。（F）For结合ERRα/PGC-1α复合物的分子对接模型，结构来源PDB 3D24；显示Chain A和B构成的三维复合物以及嵌入结合口袋的For。关键稳定作用包括与A:ALA420、A:MET258、B:LEU211、B:PRO206及B:CYS207之间的疏水作用，与A:GLN262之间的氢键（黄色虚线），以及与A:HIS341之间的两处π-π堆积作用（蓝色虚线）。（G）293T细胞分别转染野生型或Q262A突变ERRα，并同时转染ATP5B-Luc或ACADM-Luc报告载体，随后给予Veh或For 10 μmol/L处理24小时；荧光素酶活性相对于WT+Veh计算倍数变化，每组n=6。（H）对For-ERRα/PGC-1α复合物进行100 ns分子动力学（MD）模拟并分析轨迹。（I）For结合复合物的柔性谱，其中5～20和205～210区域柔性增加。所有数据以均值±SD表示，图中提供精确P值，P<0.0001采用科学计数法。A、B和G采用ART ANOVA评价抗体/启动子、处理及二者交互作用，事后两两比较采用Wilcoxon秩和检验并进行Bonferroni校正；D采用双侧精确Mann-Whitney U检验；E采用Kruskal-Wallis检验并进行Dunn多重比较。
【贡献】★★★★★
本研究表明，ERRα是AIC过程中线粒体功能障碍和氧化代谢紊乱的重要保护性调节因子。ERRα的下调在亚临床代谢异常阶段已经出现，并在疾病进一步进展过程中持续下降；心肌细胞特异性提高ERRα能够改善脂肪酸氧化、线粒体代谢及收缩功能，而降低ERRα则进一步加重代谢崩溃和心功能障碍。
研究进一步鉴定出天然异黄酮刺芒柄花素作为一种ERRα激活剂。刺芒柄花素主要通过ERRα激活广泛的代谢相关基因程序，促进脂肪酸代谢和线粒体功能，并改善AIC中的心脏收缩功能。机制研究提示，其并非主要通过直接结合游离ERRα发挥作用，而是结合并变构稳定ERRα-PGC-1α复合物，增强ERRα的转录能力及自身正反馈表达。
与此同时，人乳腺癌患者来源类器官实验显示，刺芒柄花素并未削弱多柔比星的抗肿瘤效应，并可能进一步增强其抗增殖作用。因此，研究提出一种值得进一步验证的联合干预思路：在蒽环类化疗过程中，通过刺芒柄花素改善心肌代谢以减轻AIC，同时保留甚至潜在增强抗肿瘤效应。需要强调的是，目前相关证据主要来自细胞、小鼠、小型猪及有限数量的人组织和类器官样本，其长期安全性以及在患者中的心脏保护效果仍需更大规模临床研究进一步验证。
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