高尿酸血症是由嘌呤代谢障碍引发的常见疾病，其发病机制主要与尿酸生成增多和/或尿酸排泄减少相关。作为仅次于高血压、高脂血症和高血糖的第四高发代谢性疾病，高尿酸血症同时也是慢性肾脏病、心血管疾病和糖尿病的潜在危险因素。在人体内，尿酸生成的关键限速步骤由黄嘌呤氧化酶（XO）催化，该酶既可催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤并进一步生成尿酸，亦可直接催化黄嘌呤生成尿酸。目前，高尿酸血症的治疗策略主要聚焦于抑制尿酸合成或促进尿酸排泄，其中抑制XO活性是减少体内尿酸生成的核心途径。临床常用的黄嘌呤氧化酶抑制剂（XOI）包括别嘌呤醇和非布司他等药物。然而，此类药物的各种不良反应已被广泛报道，例如会引起代谢综合征、肝肾功能损伤及心血管并发症等，部分患者还会出现荨麻疹、皮疹和瘙痒等症状。因此，研发具有XO抑制活性且不良反应少的天然产物抑制剂具有重要的临床应用价值。
近年来，天然海洋多糖因其资源丰富、生物活性多样及安全性高等优势而受到广泛关注。褐藻胶是一种酸性多糖，主要以海藻酸盐形式存在，广泛分布于海带（Laminaria japonica）和马尾藻（Scagassum）等褐藻的细胞壁和细胞间质中。除褐藻来源外，某些微生物也具备合成褐藻胶的能力，如假单胞菌（Pseudomonas sp.）等。结构上，褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古罗糖醛酸（G）两种糖醛酸单元通过α-1,4-糖苷键连接而成的线性多糖。研究表明，褐藻胶具有多种生物活性，包括抗肿瘤、抗氧化、免疫调节以及调节肠道菌群等。作为一种可持续资源，褐藻胶凭借独特的黏性、渗透性及凝胶特性等理化性质和生物功能，在医药、食品、化工等领域具有重要的应用价值。目前关于褐藻胶抑制XO活性的研究报道相对匮乏，其对XO的确切抑制作用尚不明确。因此，深入阐明褐藻胶与XO的互作机制具有重要意义。
海藻酸钠（SA）是褐藻胶的钠盐形式，是褐藻胶的典型代表。集美大学海洋食品与生物工程学院的杨蕊羽、朱艳冰*和厦门医学院药学院的李鹤宾等人采用紫外-可见吸收光谱法系统探究SA对XO的抑制活性、抑制可逆性及抑制类型；利用荧光光谱法探究SA与XO之间的结合特性，采用时间分辨荧光分析验证SA对XO的猝灭机制；通过圆二色光谱分析SA对XO二级结构的影响。本研究旨在从分子层面阐明SA抑制XO的作用机制，为开发可食用褐藻胶作为天然功能性食品补充剂以降低高尿酸血症风险提供理论依据。
1 SA对XO的抑制作用
XO是机体嘌呤代谢的关键酶，抑制其活性可有效减少尿酸生成。本研究评估不同质量浓度SA对XO的抑制活性。如图1A所示，SA对XO的抑制随着质量浓度的增加而增强，呈现浓度依赖性。当SA质量浓度为10 mg/mL时，抑制率达到45.42%。阳性对照托匹司他同样表现出浓度依赖性抑制作用，质量浓度为250 μg/mL时，抑制率达到99.38%（图1B）。托匹司他虽然能在较低质量浓度下有效抑制XO活性，但易引发胃肠道反应、过敏症状，并对肝肾器官造成损伤。SA作为源于天然海藻的线性多糖，具有良好的生物相容性，可作为增稠剂和稳定剂，已在食品和医药等领域广泛应用。与托匹司他、别嘌呤醇等药物相比，SA具有更高的安全性。上述结果表明，SA具有潜力作为一种有效的天然来源XO抑制剂，用于痛风和高尿酸血症的治疗干预。
2 SA对XO的抑制动力学和抑制类型
为评估SA对XO抑制的动力学特征，在不同酶浓度条件下建立酶促反应速率曲线。如图2A所示，所得曲线线性良好，且均交汇于坐标原点；随着SA质量浓度的增加，直线斜率逐渐降低，表明SA对XO的抑制作用属于可逆抑制类型，说明SA与XO通过非共价相互作用形成复合物，从而导致酶活性下降。进一步采用Lineweaver-Burk双倒数作图法分析SA对XO的抑制类型。如图2B所示，不同SA质量浓度下的双倒数曲线相交于第2象限，米氏常数（ K m ）随SA质量浓度增加而增大，而最大反应速率（ V max ）则随之降低，表明SA对XO的催化活性表现为混合型抑制。混合抑制说明SA既能与游离的XO结合，也可与酶-底物复合物（XO-黄嘌呤）结合，从而发挥抑制作用。如图2C所示，双倒数曲线的斜率及纵轴截距与SA质量浓度之间均呈线性关系，提示SA在XO上的结合位点可能为单一或同一类别。Dixon作图法分析显示，拟合直线线性良好，且两直线相交于第2象限（图2D），进一步表明SA与XO可能仅存在一个或一类结合位点。根据交点坐标计算得出SA的抑制常数（ K i ）为9.66 mg/mL，说明SA对XO具有一定亲和力，能够较容易且紧密地与酶结合。表1总结了常见XO抑制剂的抑制类型。降尿酸药物托匹司他的核心抑制效应是通过共价结合阻断酶活性，同时存在可逆的底物竞争作用，表现为以不可逆抑制为主、兼具可逆竞争特征的混合型抑制。别嘌呤醇作为一种嘌呤类似物，需经XO代谢激活生成活性产物别嘌呤二醇，该产物会与XO活性中心的钼辅因子形成稳定的共价键，导致酶的结构不可逆改变并丧失催化活性，长期使用有副作用风险。非布司他是一种非嘌呤抑制剂，能够直接与XO钼活性中心的钼蝶呤位点结合，通过非共价相互作用抑制酶活性，属于混合型可逆抑制。
3 基于荧光光谱分析SA对XO结构的影响
荧光光谱法可用于分析蛋白质与配体之间的相互作用，通过检测蛋白质荧光强度的变化，可测定二者之间的结合常数与结合位点数目。对于Trp、Tyr和苯丙氨酸3 类荧光发色团氨基酸，Trp的荧光强度最高，且对环境变化极为敏感，能够有效反映蛋白质构象变化；苯丙氨酸的荧光效率较低，通常不予考虑。研究表明，XO的固有荧光主要来源于Tyr和Trp残基。图3显示了在不同温度条件下，SA处理前后XO的荧光发射光谱变化。在280 nm λex下，SA自身荧光强度相对较低，可忽略不计。未添加SA时，在298 K条件下，XO的最大荧光发射波长（λmax）位于333 nm。随着SA质量浓度增加，XO-SA复合物的荧光强度显著降低（图3），表明SA与XO发生相互作用并引起荧光猝灭，影响了XO内源荧光氨基酸的微环境。此外，在不同温度下均观察到λmax发生轻微红移：298 K条件下从333 nm移至336 nm（图3A），304 K条件下从334 nm移至336 nm（图3B），310 K条件下从339 nm移至341 nm（图3C）。这一系统性红移表明，随着SA质量浓度增加，XO荧光发色团周围的微环境亲水性增强。以上荧光光谱结果表明，SA与XO之间发生相互作用，并引起显著的荧光猝灭效应。
4 SA与XO之间的结合力
如图4所示，不同温度（298、304、310 K）条件下SA对XO的荧光猝灭Stern-Volmer曲线呈现出良好的线性关系，表明猝灭机制是单一的静态或动态猝灭。在静态猝灭中，Ksv和Ka通常随着温度的升高而减小，而在动态猝灭中，Ksv往往会随着温度的升高而增加。本研究中，Ksv随着温度的升高而减小，Kq远大于最大扩散碰撞猝灭常数（2.0×1010 L/（mol·s）），同时Ka随着温度的升高而降低（表2），符合静态猝灭的特征。因此，荧光猝灭过程主要由XO-SA复合物的形成所引起，该过程属于静态猝灭机制。此外，由表2可知，在不同温度条件下测得的结合位点数n均接近1，说明XO分子上存在一个SA结合位点。实验测得的结合位点数n在1附近合理波动，这种变化可能源于样品活性或浓度测定准确性等因素，而非表示存在非整数的实际结合位点。此外，随着温度升高，n逐渐增大，表明SA对XO的荧光猝灭可能是通过改变XO的构象以及影响荧光基团周围极性环境而实现的。
5 SA与XO相互作用的热力学分析
配体和大分子之间的非共价相互作用（疏水相互作用、氢键和范德华力）可以通过反应前后的焓变（ΔH）和熵变（ΔS）确定。由表3可知，SA和XO的结合过程中ΔH和ΔS均为负值，表明结合是一个放热的过程，并且SA和XO活性中心形成大量特异性、定向的非共价键，氢键和范德华力在结合过程中起主导作用。这一热力学特征与抑制类型的动力学研究结果相印证，说明SA通过高效结合于XO的活性中心，从而有效抑制XO的活性。ΔG＜0表明结合过程是自发的。ΔG随着反应温度的升高而增加，说明在较高温度条件下不利于SA与XO之间的结合。
6 SA与XO相互作用的同步荧光光谱分析
同步荧光光谱可以提供大分子和配体相互作用时在特定波长差（Δλ＝15 nm或60 nm）条件下Tyr和Trp残基微环境变化的信息。如图5A所示，随着SA质量浓度增加，Trp残基（Δλ＝60 nm）的 λ max 出现轻微红移（从278 nm到279 nm）。当Δλ＝15 nm时，同样发现轻微变化（从287 nm到289 nm）（图5B）。上述 λ max 的红移现象提示，SA的结合导致Tyr和Trp残基周围微环境的极性增加、疏水性降低。在相同SA质量浓度下，Δλ＝60 nm时的荧光猝灭程度显著高于Δλ＝15 nm时的猝灭程度，同时Δλ＝60 nm处的RSFQ明显大于Δλ＝15 nm处的RSFQ（图5C）。当SA质量浓度为8 mg/mL时，Trp的荧光强度下降了40.1%，而Tyr的荧光强度仅下降15.4%。上述结果表明，SA对Trp残基荧光的猝灭效应显著强于对Tyr残基的猝灭效应，Trp残基对XO的荧光猝灭贡献更大，提示结合的SA分子更靠近XO蛋白中的Trp残基。
7 SA对XO荧光猝灭的影响
时间分辨荧光光谱能够反映发色团的荧光寿命，是确定小分子物质猝灭机理的可靠手段。由于静态猝灭源于基态配合物的形成，其平均荧光寿命通常不随猝灭剂浓度的增加而变化。而在动态猝灭中，配体-蛋白质复合物被激发，相关荧光团的寿命会缩短。为了进一步验证SA对XO的荧光猝灭类型，本研究测定了SA处理前后XO的时间分辨荧光光谱。如图6所示，在添加SA后，游离的XO和SA-XO复合物的荧光衰变曲线非常相似。采用双指数衰减模型拟合荧光衰减曲线，所有χ2均小于或等于1.3（表4），表明拟合结果良好。加入SA后，XO的荧光寿命未发生显著变化，这直接证实了SA通过形成稳定的基态配合物对XO的固有荧光进行静态猝灭，该结果与Stern-Volmer方程得到的结果相印证。
8 SA对XO二级结构的影响
圆二色光谱能快速评估大分子和配体相互作用前后二级结构的变化。如图7所示，加入SA后，XO的圆二色光谱在210～220 nm附近表现出特征性的负峰，是β-折叠的特征峰；随着SA的加入，XO的圆二色光谱强度增加，负峰出现轻微蓝移，表明SA处理后的XO产生了构象变化。如表5所示，与游离XO相比，XO-SA复合物中α-螺旋相对含量从19.90%增加到29.80%，β-折叠相对含量从29.10%减少到19.50%，β-转角结构基本不变，而无规卷曲相对含量从36.20%略微下降到32.30%。α-螺旋含量增加和无规卷曲含量下降说明XO结构的有序性提升，而β-折叠含量减少说明XO结构的刚性和稳定性提升。这些结构变化表明，SA与XO结合主要诱导了酶二级结构中的一部分β-折叠和无规卷曲结构转化为α-螺旋结构，使XO的构象趋于更加致密，不利于底物黄嘌呤进入酶的活性中心进行结合，从而降低了XO的催化活性。槲皮素和咖啡醇也通过增加α-螺旋含量，减少β-折叠和无规卷曲含量影响XO的二级结构，从而抑制XO对黄嘌呤的酶促反应。XO在肝脏及肠道等多种组织中广泛表达。SA可作为XO的潜在抑制剂，然而其在体内的具体作用机制仍有待阐明，这是未来研究的核心方向。
9 结论
本研究综合运用酶促动力学与多光谱技术，揭示了SA可作为XO的可逆混合型抑制剂，通过静态荧光猝灭机制降低XO荧光强度，与XO结合，并诱导其二级结构发生构象重排。该作用表明SA可通过改变酶的空间结构干扰其催化功能。本研究从分子层面揭示了SA对XO的抑制机制，可为阐释褐藻胶调控尿酸代谢的分子基础及开发新型XO抑制剂提供理论依据。
引文格式：
杨蕊羽, 李鹤宾, 朱远翔, 等. 海藻酸钠对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用及其抑制机制[J]. 食品科学, 2026, 47(10): 55-62. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250921-160.
YANG Ruiyu, LI Hebin, ZHU Yuanxiang, et al. Inhibitory effect and mechanism of sodium alginate on the activity of xanthine oxidase[J]. Food Science, 2026, 47(10): 55-62. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250921-160.
实习编辑：俞逸岚；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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