化学反应驱动的超分辨成像
超分辨荧光显微镜技术自问世以来，通过突破光学衍射极限，极大地推动了我们对复杂生命活动的理解。然而，这些技术几乎无一例外地依赖外部光源激发荧光分子，这一核心机制从根本上限制了成像的时空分辨率和长期活细胞兼容性。高强度激光激发不仅带来光毒性和光漂白问题，也限制了成像的持续时间和通量。为解决这一难题，科学家将目光转向了化学反应激发的发光现象，如电化学发光、化学发光和生物发光。这些无需外部光源的化学发光方式，虽拥有零背景噪声和高灵敏度的优势，但长期受限于极低的光子预算——传统方法通常需要数十秒的曝光时间来累积一张图像，导致其时空分辨率远无法与超分辨荧光显微镜相媲美。 针对这一瓶颈，浙江大学冯建东教授（出生于1992年，国家级青年人才）、哈尔滨工业大学赵唯淞教授（出生于1995年，国家优青）等领衔的研究团队，提出了一种名为RIED的化学基超分辨成像框架。RIED通过一种创新的时空记录策略，捕捉由单个反应驱动的发光波动，并结合熵权相关分析与反卷积重构算法，将原本低光子输出的化学发光信号转化为超分辨图像。该技术成功将电化学发光、化学发光和生物发光的成像分辨率提升至约100纳米。同时，借助生物发光优异的生物相容性，研究团队实现了长达41小时不间断的超分辨活细胞成像，首次在单细胞水平上持续追踪了线粒体转移的动态全过程。该成果以题为“Luminescent-reaction-enabled super-resolution imaging”发表在最新一期《Nature》上。
冯建东教授（左）和赵唯淞教授（右）
RIED核心策略
RIED技术的核心在于其巧妙的数据采集与重构逻辑。不同于传统方法仅记录长时间累积的“静态”图像，RIED通过高速相机捕获一系列短曝光图像，形成包含时间维度的图像序列（图1a、1b）。在这一序列中，每个发光反应事件都是一个独立的“时空指纹”——具有零激发光背景、高信噪比以及在反应位点与暗背景间的高对比度波动。研究团队对序列中的光子事件进行时空互相关分析，排除了重叠发射体主导的像素，并有效地将点扩散函数（PSF）宽度变窄（图1c）。此外，针对电化学发光固有的异质性，他们创造性地引入了空间熵图对局部信息含量进行量化，用于优化相关累积量。最后，通过反卷积处理，进一步锐化了在低光子预算条件下的空间分辨率和图像对比度。这些步骤协同作用，使得RIED能从看似杂乱的发光信号中，提取出超越衍射极限的结构信息。
图 1 | RIED 概念
电化学发光成像
在电化学发光成像中，研究团队首先优化了发光体系。他们发现使用Bis-tris作为共反应物，可将电化学发光细胞成像亮度提升约1000倍（图2b、2c），这使得在20毫秒曝光时间下清晰观察微管丝成为可能。结合RIED重构，电化学发光首次实现了对细胞内微管、线粒体等细胞器的超分辨成像，分辨率达到97纳米（图2f），与基于荧光的SACD超分辨成像结果高度一致（图2d、2e）。研究者进一步通过步进式电压调控，克服了电化学发光激发深度有限的难题，成功构建了三维超分辨图像（图2k），在轴向和侧向上分别可分辨间距为235纳米和116纳米的微管结构。得益于其高时空效率，RIED-ECL还实现了大面积（0.53×0.53 mm²）的超分辨成像（图2n），展示了其在高通量应用中的潜力。
图 2 | RIED在ECL中的表现
高灵敏度成像
由于化学反应仅在电极表面触发且无需激发光，电化学发光成像天然具备极高的表面灵敏度。RIED-ECL能够清晰观察到靠近电极表面的微管细丝（图3a），并且其弯曲度分析揭示了不同分裂期微管的独特排列方式（图3b）。更为重要的是，该技术的高灵敏度使其在生物标志物检测上展现出巨大优势。在对癌胚抗原的单细胞成像中，RIED-ECL的检测阈值相比荧光SACD方法降低了8倍（图3e）。这种提升主要归功于电化学发光完全消除了背景荧光，从而为超灵敏生物检测和单细胞分析提供了全新的技术手段。
化学发光和生物发光
RIED的原理不仅限于电化学发光，它同样适用于化学发光和生物发光系统。对于化学发光，研究团队利用基于生物发光共振能量转移的GeNL探针进行成像。由于化学发光在溶液中可实现均匀激发，他们结合步进扫描获得了线粒体的三维分布图（图4b）。RIED-CL在侧向和轴向分别达到了102纳米和221纳米的分辨率（图4c-4e），其结果与荧光超分辨成像高度吻合。这证明了RIED作为一种普适性的化学成像框架，能够适配不同的化学激发体系。生物发光作为化学发光的一种特殊形式，发生在活体生物内。RIED-BL在活细胞中成功实现了对微丝、内质网和微管等多种细胞器的超分辨成像，分辨率达到117纳米（图4f-4h）。更重要的是，无需激光照射的特性赋予了生物发光卓越的生物相容性。研究者将RIED-BL与先进的活细胞超分辨荧光技术——结构光照明显微镜（SIM）进行了对比。在连续激光照射下，SIM在18分钟内即出现严重的光漂白，而RIED-BL在相同时间内发光强度保持稳定，并能持续长达41小时（图4i-4k）。这种极端的成像稳定性，使得连续观察活细胞在近乎生理状态下的动态过程成为可能。
追踪生命活动
利用RIED-BL的长时程优势，研究团队对活细胞中的线粒体动力学进行了连续观测。他们不仅捕捉到了单个线粒体的分裂、融合和形变事件，还对线粒体的运动速度、直径和数量进行了长达41小时的统计分析（图5a、5b）。结果显示，细胞外围的线粒体运动更快，而核周区域的运动较慢且呈周期性波动。在成像后期，线粒体数量减少、平均直径增加，这可能是细胞凋亡的特征。尤为重要的是，RIED-BL首次实现了对线粒体在细胞间转移过程的连续、超分辨追踪。他们观察并量化了两种不同的转移模式：一种是近乎直线的快速“直接运动”；另一种则包括初始移动、短暂停滞再到定向运动的“间接运动”过程（图5d）。这些发现为理解细胞间通讯、损伤修复及肿瘤微环境调控等提供了前所未有的动态视角。
总结与展望
总而言之，RIED技术的诞生标志着超分辨显微镜从依赖光学激发物理向化学反应驱动化学的范式转变。它不仅提供了与主流活细胞超分辨荧光显微镜相媲美的空间分辨率，更同时具备了大视野、高灵敏度、低光毒性和超长时程连续观察等综合优势，打破了现有超分辨技术在时空分辨率、成像深度和持续时长间的权衡困境。未来，随着该技术与特定生化反应的进一步结合，RIED有望将成像从“看位置”提升至“看活性”，为揭示生命活动背后的化学动态提供一个独特的、无激光的“化学之眼”。
（来源：高分子科学前沿版权属原作者 谨致谢意）
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