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Introduction
丙烯酰胺（AA）是一种广泛应用于有机合成与聚合物生产的工业化学品。鉴于其对啮齿类动物具有致癌作用，国际癌症研究机构于1994年将其归类为可能对人类致癌的物质（2A类），同时明确其兼具潜在的神经毒性与遗传毒性。
膳食摄入的AA可引发多种毒性损伤，包括遗传毒性、神经毒性、肝毒性、致癌性、生殖毒性及发育毒性等。除上述直接毒性外，AA导致的机体功能异常与代谢紊乱等健康危害同样不容忽视。为保障人体健康，有必要开展综合性风险评估，全面考量其对机体内分泌激素水平的干扰作用及对器官功能的影响。但目前，针对婴幼儿这类生长发育易感人群的膳食AA健康危害研究仍较为匮乏。肝、肾是机体主要的代谢器官，对有害物质高度敏感；由于婴幼儿对损伤的耐受度较低，针对该群体开展肝肾功能的风险评估尤为必要。此外，脾脏作为机体质量要的免疫器官，在抵御外来有害物质侵害方面发挥着关键作用。基于此，本研究选取肝、肾、脾作为AA毒性作用的主要靶器官。
以往研究借助啮齿类动物模型，主要通过三种途径探究外源性AA的经口毒性：食物摄入、饮水摄入及灌胃给药。高剂量AA暴露主要源于膳食摄入。在上述三种暴露途径中，经食物摄入的AA生物利用度最高，可达32%~52%，而大量具有生物活性的AA会对机体产生毒性作用。因此，亟需针对易感人群，开展膳食途径下内源性（食品自身生成）与外源性AA摄入的健康风险评估，尤其要聚焦饼干这类AA高暴露食品基质。
本研究旨在评估饼干膳食来源的AA暴露对发育期雌性Wistar幼鼠的潜在危害。实验将幼鼠分为内源性AA组及外源性AA低、中、高剂量组（Exo-L、Exo-M、Exo-H），从血液学、激素水平、免疫功能及肝肾功能损伤等维度，全面评估AA的健康危害。本研究的设计初衷在于明确内源性与外源性AA暴露对易感人群的潜在健康风险，同时为食品监管部门开展风险评估，提供食品基质中AA的危害特征数据支撑。
Results
激素水平
AA是一种易引发激素紊乱的敏感性化合物。血清性激素会加剧丙烯酰胺所致的功能损伤，例如卵巢功能受损、生殖细胞DNA损伤加重以及生育能力下降等。雌二醇（E₂）和生长激素（GH）对发育期雌性幼鼠的性发育与骨骼生长具有重要作用。因此，本研究选择检测雌二醇和生长激素的水平，以评估丙烯酰胺暴露对发育期雌性幼鼠的内分泌干扰效应（图1）。
与对照组相比，AA暴露组大鼠的血清E₂和GH水平呈剂量依赖性升高。此外，所有外源性AA暴露组的E₂水平均呈现极显著升高（P＜0.001），而内源性暴露组的E₂水平未观察到显著差异。针对溶剂接触型AA生殖毒性的研究表明，AA暴露会导致E₂水平升高。该现象可能是由于AA损伤睾丸间质细胞，通过增强肝脏中芳香化酶的活性，加速睾酮向E₂的转化所致。但需要注意的是，E₂水平显著升高会干扰正常发育进程，加速子宫成熟，进而引发性早熟。除此之外，激素与免疫系统之间存在复杂的调控关系，E₂水平失衡可能会降低免疫细胞功能，诱发感染和组织损伤。
所有外源性AA浓度暴露组的发育期大鼠，其GH水平均显著升高（P＜0.001）。与E₂水平的变化趋势不同，内源性暴露组的GH水平显著高于对照组（P＜0.05），这提示内源性AA暴露对GH的影响比E₂更为敏感。GH水平升高可能与肝肾功能不全有关，因为肝脏和肾脏对GH的代谢速率减慢，会导致血液中GH水平上升。因此，必须对肝肾功能的损伤情况进行评估。在本研究中，尽管大鼠体质量未发生变化，但肝脏系数降低，这可能是激素敏感性脂肪酶的磷酸化水平与活性增强，进而刺激肝细胞脂肪分解所导致的。
免疫功能
免疫毒性与细胞毒性测定
本研究共检测了5项与免疫毒性和细胞毒性相关的指标（图2）。在免疫毒性相关指标方面，所有AA暴露组的溶菌酶（LYSO）、一氧化氮（NO）、免疫球蛋白G（IgG）及免疫球蛋白M（IgM）这4项指标的水平，均随AA剂量的增加呈剂量依赖性升高。尤为值得注意的是，与对照组相比，3个外源性剂量组的上述指标均呈现极显著升高（P＜0.001）。此外，内源性暴露组的LYSO水平显著升高（P＜0.05），IgM和IgG水平则呈极显著升高（P＜0.01）；而NO水平未观察到显著差异。
LYSO水平升高可反映机体感染的严重程度，且会对先天性免疫疾病中的免疫功能产生剂量依赖性影响。NO作为一种细胞间信使，其水平升高标志着免疫功能被激活；免疫系统细胞可通过生成一氧化氮来抵御有毒物质。一项采用低剂量溶液基质进行AA长期暴露的研究显示，IgG和IgM水平呈指数级上升。上述结果表明，大鼠通过溶液或饼干膳食摄入AA均会产生免疫毒性。这些指标提示我们，饼干基质中的内源性AA具有免疫毒性，可能会干扰大鼠的免疫系统，进而引发免疫功能紊乱。免疫毒性指标升高被视为氧化应激的标志物，且可能诱发异常免疫反应，进一步提高机体的过敏易感性。
尽管乳酸脱氢酶（LDH）水平未呈现显著的剂量依赖性升高，但外源性中剂量组（Exo-M）和外源性高剂量组（Exo-H）的LDH水平仍分别出现显著升高（P＜0.01、P＜0.05）。LDH是生物体内一种重要的细胞代谢酶，其血液活性升高常见于肝、肾损伤等组织损伤情况。因此，饼干膳食中的AA对肝肾的影响有待进一步研究。
免疫表型分析
鉴于免疫毒性指标的血清水平显著升高，必须通过细胞免疫进一步评估机体的免疫功能。淋巴细胞亚群的稳定是维持正常免疫功能的必要条件，同时也是细胞免疫的重要指标。因此，本研究采用流式细胞术检测外周血中CD3⁺ T细胞、CD45RA⁺ B细胞、CD8α⁺细胞毒性T细胞（Tc细胞）及CD4⁺辅助性T细胞（Th细胞）的百分比，以此评估淋巴细胞亚群的稳定性。
与对照组相比，免疫表型的显著差异仅体现在外周血CD3⁺T细胞的百分比上。此外，外周血中未检测到CD45RA⁺ B细胞、CD8α⁺细胞毒性T细胞及CD4⁺辅助性T细胞的百分比数据。尽管各组间CD45RA⁺ B细胞的百分比未观察到显著差异，但所有AA暴露组的该指标均呈升高趋势。组间未呈现显著差异，可能是由于组内差异波动较大所致。基于此，本研究在图3A中展示了各AA暴露组CD3⁺T细胞的百分比统计图，并在图3B中对各组间CD3⁺T细胞的百分比进行了对比分析。
Exo-H的CD3⁺ T细胞百分比显著高于对照组（P＜0.01）（图3B）。这一结果提示，Exo-H组饼干膳食中的AA会破坏淋巴细胞亚群的稳定性。CD3⁺ T细胞百分比升高会对大鼠的细胞免疫系统产生毒性作用，且在一系列与急慢性肝肾疾病相关的炎症及自身免疫性疾病中具有致病作用。此外，Exo-H的免疫毒性指标与CD3⁺ T细胞百分比均显著升高，这表明Exo-H AA对体液免疫和细胞免疫均具有毒性作用。本研究发现，所有AA暴露组的CD45RA⁺B细胞百分比均呈升高趋势，这提示AA可能会增强外周免疫系统的活化程度。而CD8α⁺细胞毒性T细胞与CD4⁺辅助性T细胞的百分比未出现显著差异，这可能是由于在15天的暴露周期内，AA的累积毒性尚未达到足以引发显著变化的阈值。
免疫组化评估
CD4⁺和CD8⁺细胞单克隆抗体分别标记辅助性T细胞（Th细胞）和细胞毒性T细胞（Tc细胞）。Exo-H中观察到CD3⁺T细胞占比显著升高。脾脏是机体最大的外周免疫器官，基于此，本研究选取两种具有代表性的CD4⁺和CD8⁺ T细胞，对大鼠脾脏组织进行免疫组织化学检测，以进一步探究AA对该器官中T细胞的影响。各组代表性图片以及所有组别CD4⁺和CD8⁺T细胞的定量检测结果见图4。
在对照组中，CD4⁺这一糖蛋白呈黄至棕褐色，在Th细胞和Tc细胞表面分布正常、显色强度均一，且主要存在于白髓的动脉周围淋巴鞘（PALS）区域。如图4A所示，AA暴露组与对照组的CD4⁺免疫细胞吸光度密度值（AOD）未观察到显著差异。
图4B显示的是细胞毒性淋巴细胞亚群—脾脏CD8⁺淋巴细胞，在对照组大鼠体内，该细胞呈黄至棕褐色沉淀状，主要分布于PALS及红髓（RP）附近。与对照组相比，Exo-H的CD8⁺细胞AOD显著升高（P＜0.05）；其余AA暴露组的CD8⁺细胞AOD则未出现显著变化。
CD4⁺和CD8⁺ T细胞数量的改变通常意味着免疫系统失衡。本研究仅在Exo-H中观察到CD8⁺细胞占比显著升高，这提示该组大鼠存在免疫表达失衡的情况，而这种失衡可能引发免疫调节紊乱，进而诱发免疫缺陷、过敏等反应。Exo-H大鼠外周血中CD3⁺ T细胞数量与脾脏中CD8⁺ T细胞数量均出现升高，这一现象进一步表明其免疫系统存在失衡，可能会导致免疫系统功能障碍。脾脏免疫功能障碍的危害是多方面的，包括免疫功能下降、免疫调节紊乱引发的炎症与过敏反应，以及血液学指标异常等潜在风险。免疫系统调节紊乱会促使肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子释放增加，进而引发炎症反应。若免疫功能障碍导致脾脏出现严重损伤，则可能难以实现恢复。
肝脏和肾脏损伤
血清生化检测
本研究检测了大鼠摄入含内源性和外源性AA的饼干膳食后，多项反映肝肾功能的血清生化指标（图5）。肝肾功能指标是临床评估肝肾功能状态的检测指标，可有效反映肝肾功能不全的程度。除总蛋白（TP）和白蛋白-Ⅱ（ALB-Ⅱ）外，其余血清肝功能酶类指标（ALT、AST、ALP）及肾功能指标（尿素（UREA）、血清肌酐（CREA-S））均随外源性AA暴露剂量的增加而升高。在内源性AA暴露情况下，仅TP这一项指标出现显著差异。AA各暴露组与对照组之间的ALB-Ⅱ水平未观察到明显差异。
与对照组相比，Exo-H中所有升高的肝功能指标水平均极显著升高（P＜0.001）；Exo-M的上述指标则呈极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）变化。而在Exo-L的各项肝功能指标中，仅AST水平出现极显著变化（P＜0.01），这提示大鼠可能存在轻度肝损伤。但需要注意的是，ALT、AST及ALP水平大幅升高，是混合型肝损伤的标志，且可能诱发急性肝损伤。这一结果表明，Exo-M与Exo-H的大鼠出现了严重的混合型肝损伤。AA毒性作用引发的自由基与氧化应激反应，可能会导致肝细胞膜破裂，进而破坏肝细胞的完整性，最终造成血清中ALT与AST水平升高。
Exo-M与Exo-H的UREA和CREA-S水平均极显著升高（P＜0.001）；Exo-L的这两项指标也呈极显著变化（P＜0.01）。这两项指标是反映肾功能的敏感性指标，其水平显著升高意味着大鼠存在严重肾功能不全，且可能提示急性肾损伤的发生。该结果表明，外源性AA暴露组的大鼠可能出现了肾脏损伤。另有一项类似研究发现，给予大鼠50 mg/（kg·d）的AA处理后，其体内尿素水平升高，这一现象同样提示肾脏存在损伤。
组织病理学检查
病理学检查是明确诊断的金标准之一。该检查的结果客观、真实且可靠，因其反映的是组织发生的实质性病变。本研究通过组织病理学观察，探究摄入含AA的饼干膳食对大鼠肝、肾造成的损伤情况。图6为肝、肾组织的代表性病理切片图像。对照组大鼠的肝、肾组织学结构未出现明显异常或病理性改变：肝细胞排列整齐、胞质丰富；肾小球形态规则、大小正常；肾小管排列有序，上皮细胞整齐划一。图6的苏木精-伊红（HE）染色结果显示：内源性暴露组与Exo-H的肝组织出现明显的肝细胞脂肪变性（绿色箭头）；Exo-L与外源性高剂量组的肝组织可见炎症细胞浸润（黄色箭头）及肝细胞坏死（黑色箭头）；Exo-M的肝组织则出现炎症细胞浸润（黄色箭头）和肝细胞水肿（红色箭头）。在肾脏组织方面，内源性暴露组与外源性高剂量组的肾组织可见明显炎症细胞浸润（黄色箭头）；外源性高剂量组的肾组织出现上皮细胞水肿（绿色箭头）；而内源性暴露组与所有外源性暴露组的肾组织均出现肾小球及肾小管萎缩（空心箭头）。
外源性AA暴露组大鼠的肝、肾病理损伤程度与AA剂量呈相关性，其中以Exo-H的损伤最为严重。结合大鼠血清肝肾功能指标及免疫毒性指标显著升高的结果，可判定Exo-H大鼠出现了肝肾功能及免疫系统的异常。内源性AA造成的病理损伤同样可能引发肝肾功能异常。另有研究显示，连续2周给予大鼠50 mg/（kg·d）的溶液型AA，也会造成类似的肝肾损伤，其潜在病理机制与氧化应激和炎症反应相关。
综合上述研究结果可见，尽管溶液基质中的AA浓度高于饼干基质，但二者产生的毒性作用却相似，这可能是由于通过食物基质摄入的AA具有更高的生物利用度。肝、肾是机体质量要的代谢器官。肝脏代谢相关研究表明，给予大鼠25 mg/kg的溶液型AA后，其肝脏内细胞色素P4502E1（CYP2E1）蛋白表达量显著下降，原因在于AA可在细胞色素P450及CYP2E1酶的作用下发生生物转化生成缩水甘油酰胺，进而降低自身毒性。在肝组织氧化应激指标方面，50 mg/kg AA暴露会导致MDA水平升高，同时使GSH水平显著下降。此外，AA诱导产生的过量活性氧（ROS）与炎症反应加剧密切相关，AA暴露组大鼠肝脏内的炎症相关基因白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及核因子-κB（NF-κB）均呈高表达状态。
不仅如此，针对20 mg/kg AA致大鼠肾毒性的研究发现，肾组织MDA水平随剂量增加而升高，GSH活性则随剂量增加而下降，呈现明显的剂量依赖性；同时，AA暴露组大鼠肾脏的IL-1β、TNF-α及NF-κB水平也显著高于对照组。AA可在肾脏中诱发氧化应激反应并促进ROS生成，而ROS水平升高会进一步推动细胞促炎因子的合成。婴幼儿及儿童处于生长发育期，肝肾功能尚未发育完善，此阶段若发生肝肾损伤，会导致机体蛋白质合成功能受损、免疫力下降，进而出现生长迟缓、上呼吸道感染等症状。
进一步研究表明，与对照组相比，AA处理组大鼠的肠道通透性显著增加，血清内皮素-1（ET-1）及D-乳酸水平升高幅度达75%，这提示AA会增加肠道通透性并造成小肠黏膜损伤。肠道组织HE染色结果显示，AA暴露组大鼠肠道黏膜损伤严重，表现为上皮细胞坏死、肠绒毛间距增宽、肠绒毛结构破坏。肠道通透性增加、肠屏障功能受损，会使AA更易进入血液循环，进而对肝、肾、脾等器官造成损伤。因此，亟需探索调控肠屏障功能的有效方法，以减轻AA对靶器官的毒性作用。该方向将成为我们未来的重要研究课题，同时也是保障人类健康的关键切入点。
Conclusion
本研究结果表明，内源性AA（即饼干中自行生成的AA）会显著影响GH水平，使LYSO、IgG及IgM水平升高，并可导致发育期雌性幼鼠产生免疫毒性，同时引发其肝脏出现肝细胞脂肪变性，肾脏出现炎症细胞浸润以及肾小球和肾小管萎缩的病理改变。除上述内源性丙烯酰胺影响的指标外，外源性丙烯酰胺还会显著影响E₂水平、免疫毒性相关指标NO及细胞毒性相关指标LDH的水平，同时干扰肝肾功能相关指标，造成与剂量相关的急慢性肝肾损伤。总体而言，外源性AA会对机体产生剂量依赖性损伤。本研究结果证实，饼干基质中的内源性AA可通过多种途径对机体造成损伤，这一发现也引发了人们对于食物基质中AA摄入风险的担忧。后续仍需开展组织代谢组学分析及肠道通透性检测等相关研究，以全面阐释膳食AA危害机体的分子机制，这对于相关损伤的预防和治疗具有重要意义。未来的研究应致力于通过优化产品工艺、改良配方及研发微生物减毒技术等手段降低AA的生成量。此外，及时更新膳食摄入建议，并严格管控婴幼儿等易感人群的AA摄入量，也是保障食品安全的有效措施。
Health hazards associated with dietary acrylamide exposure from the biscuit diet of growing female rat pups
Yan Chen, Yue Wu*, Heqi Sui
National Engineering Research Center of Rice and Byproduct Deep Processing, Food Science and Engineering College, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China
*Corresponding author.
Abstract
Acrylamide (AA) is a harmful substance widely found in infant and child biscuits; however, the health hazards of AA, especially endogenous AA, in the biscuit matrix is poorly understood. This study aimed to determine the effects of endogenous (0.11 mg/(kg bw·day)) and exogenous (1.31, 5.23, and 10.13 mg/(kg bw·day)) AA exposure from biscuit diet on the hematology, hormone levels, immune function, and liver and kidney damage in growing female rat pups. For the hematological indices, a quadratic reduction was observed in percentage of neutrophils (Neu%) and percentage of eosinophils (Eos%) in the leukograms and in mean corpuscular hemoglobin concentration and platelet in the erythrograms in all the AA-exposed groups. In terms of hormones, extremely remarkably elevations in estradiol (E2) and growth hormone (GH) levels were associated with exogenous AA, and a significant increase in GH levels was noted in the endogenous AA group. Regarding immune function, endogenous and exogenous AA showed a dose-dependent immunotoxic effect on lysozyme (LYSO), nitric oxide (NO), immunoglobulin (Ig)G, and IgM. In particular, the lactate dehydrogenase (LDH) activity was significantly high in the exogenous medium dose (Exo-M) and exogenous high dose (Exo-H) groups, and the percentage of CD3+ T cells in the blood and CD8+ expression levels in the spleen were significantly elevated in the Exo-H group. For liver and kidney function, exogenous AA had a dose-dependent effect on alanine aminotransferases (ALT), aspartate transferases (AST), alkaline phosphatase (ALP), urea nitrogen (UREA), and creatinine (CREA-S). In addition to the dose-dependent effect on the pathological changes in the liver and kidneys, the endogenous AA group presented with hepatocellular steatosis, kidney inflammatory infiltrates, and glomerular and tubular atrophy. Overall, our findings suggested the dose-dependent harmful effect of endogenous and exogenous AA. Special attention should be paid to the damage caused by exposure to endogenous AA. Stringent AA intake guidelines and measures are required to minimize AA levels in the food matrix.
Reference:
CHEN Y, WU Y, SUI H Q. Health hazards associated with dietary acrylamide exposure from the biscuit diet of growing female rat pups[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(7): 9250516. DOI:10.26599/FSHW.2025.9250516.
翻译： 田雨欣（实习）
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片：摄图网
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