第一次接触“试管婴儿”，很多人会问同一个问题：“胚胎冷冻，不就是把胚胎冻成一个小冰块吗？”答案恰恰相反。现代玻璃化冷冻的核心目标，是尽量不让胚胎内部产生冰晶。而更有意思的是——为了做到这件事，人类整整和一滴水较劲了半个多世纪。
这段历史里，有贴错标签的试剂、液氮中的小鼠胚胎、农场里的小牛，还有一个叫Zoe的女婴。今天，就让我们把这段技术发展史梳理一遍。
话题主持：新民晚报记者 左妍
胚胎由细胞组成，细胞内外都含有大量水分。降温时，如果细胞内形成冰晶，可能直接破坏细胞结构；细胞外水结冰后，未冻结液相中的溶质浓度升高，也可能造成过度脱水及渗透性、化学性损伤。
低温生物学要解决的核心，不是单纯把温度降得更低，而是在超低温保存的同时，既减少胞内冰晶，又控制溶液效应。
围绕“如何处理细胞里的水”，人类逐步摸索出几条技术路径。
试剂瓶标签贴错 意外找到解题方向
1948年的伦敦国家医学研究所，Christopher Polge、Audrey Smith、Alan Parkes三位研究者，正在开展公鸡精子冷冻复温活性实验。
早期实验屡屡失败，直到其中一批样本复温后，精子存活率出乎意料地高。但后续重复实验再也无法复现该结果。
科研人员核查试剂瓶才发现：实验时试剂瓶标签被贴错，研究者误把甘油贴上果糖标签，实际使用的并非预设的果糖，而是甘油！这次偶然发现让研究者意识到，可以利用冷冻保护剂改变细胞内外水分和溶液状态，配合细胞脱水，降低有害冰晶和溶液效应造成的损伤。
1949年，该研究发表于《自然》杂志，奠定了现代低温生物学的重要基石。这就是第一个解题方向：既然细胞内的水可能形成有害冰晶，那么就通过冷冻保护剂和控制脱水，减少可形成冰晶的水，并降低冻结损伤。冷冻保护剂可改变细胞内外水分理化状态，配合脱水降温，减少有害冰晶生成。
让水慢慢“走出去” 慢速冷冻技术诞生
从精子冷冻跨越到哺乳动物胚胎冷冻，科研工作者又走过二十余年。1972年，Whittingham、Leibo和Mazur在《科学》发表里程碑研究：小鼠胚胎经超低温保存复温后仍可继续发育。
在2500多枚早期胚胎实验中，不同冷却复温条件下，50%—70%胚胎冻融后可发育至囊胚。
放在五十多年前，这一发现的意义非同小可：研究有力证明，哺乳动物早期胚胎经过超低温保存和复温后仍可继续发育，并为慢速冷冻奠定重要基础。
慢速冷冻并不是越慢越好，核心是通过受控降温让细胞逐步脱水，胞内含水量下降，胞内冰晶风险随之降低。
但风险有两面：降温过快，细胞来不及脱水，胞内结冰致损伤；降温过慢，则会使细胞在高度浓缩的细胞外溶液和高渗环境中停留过久，增加溶液效应及过度脱水损伤。必须依靠程序化冷冻设备，严格管控降温窗口，规范保护剂、脱水、复温全套流程。
畜牧业也推动了胚胎冷冻的发展。1973年，Ian Wilmut和L.E.A.Rowson报道了世界第一头由冻融胚胎获得的小牛。优质种牛遗传资源珍贵，冷冻胚胎可长期保存、跨地域运输，产业需求成为早期技术发展的重要推动力。Wilmut后来还参与了克隆羊“多莉”的研究。
1983年，墨尔本的Alan Trounson与Linda Mohr团队在《自然》发表研究：一枚8细胞冷冻人类胚胎复温移植后成功获得临床妊娠。但这次妊娠结局并不理想，孕24周因胎膜早破继发感染性绒毛膜羊膜炎终止，没能实现足月分娩。即便没有活产，依然证实冷冻后的人类胚胎仍然具备发育潜能。很多历史性的“第一次”，都是距离圆满最近的尝试。
1984年3月28日，澳大利亚墨尔本维多利亚女王医学中心迎来Zoe Leyland。她是世界上最早也是被广泛公认为第一例由冻融胚胎获得的活产婴儿，是人类胚胎冷冻史上的里程碑。Zoe依靠的仍是程序化慢速冷冻技术，而非现在主流的玻璃化冷冻。出于隐私保护，医院没有立刻对外公布消息，直到4月上旬才公开相关信息。同年，荷兰鹿特丹Zeilmaker团队也完成冻融胚胎临床妊娠。
1984年，人类进一步证实：经过低温保存和复温的人类胚胎，仍然可以继续发育并获得活产。
让水来不及结冰 玻璃化冷冻登场
1985年，Rall和Fahy在《自然》发表经典论文，完成小鼠胚胎-196℃无冰晶低温保存，玻璃化冷冻技术正式登上历史舞台。
慢速冷冻依靠缓慢脱水，主动规避细胞内冰晶；玻璃化冷冻则换了全新思路：适度脱水，搭配专用冷冻保护剂，极速跨过冰晶生成的温度区间，让水分子来不及排列形成冰晶晶格，整个细胞体系直接进入无定形的玻璃态。
有一个大众常见误区，需要澄清：玻璃化冷冻不是把胚胎变成玻璃实体，而是一种特殊物理状态，整体呈固态，但水分子排布杂乱无序，没有冰块规整晶格，使体系尽可能绕开冰晶形成，进入无定形的玻璃态，从而大幅降低有害冰晶造成的损伤。
玻璃化冷冻简化为三步：
第一步，适度脱去细胞内部多余水分；第二步，冷冻保护剂对细胞形成防护；第三步，极速跨越结晶温度区间，水分子来不及形成冰晶，胚胎代谢被按下暂停键。
玻璃化理论框架成型之后，最大难题是如何实现极快的升降温速度。关键不在于液氮本身，而在于缩小样本承载体积。2005年前后，Cryotop等微型载体技术不断完善：把胚胎/卵母细胞放置在极微量液体环境中。物理原理十分简单：载体体积越小，热交换效率越高，升降温速度越快，最大程度规避结晶以及复温再结晶风险。
更快的热交换效率，也可以降低对高浓度冷冻保护剂的依赖。玻璃化冷冻不是单纯依靠低温或者极速降温，而是保护剂浓度、渗透压、载体体积、环境温度、操作时长多维度的精密平衡。
现代胚胎冷冻 追求多方动态平衡
时至今日，仍然存在不少认知误区：冷冻保护剂浓度越高越安全，胚胎脱水越彻底效果越好。事实恰恰相反，高浓度冷冻保护剂本身带有细胞毒性；过度脱水、长时间处于脱水环境，同样会损伤胚胎活性。
现代临床玻璃化冷冻，追求多方动态平衡：细胞留存水分比例、保护剂浓度、每一步操作耗时、环境恒温、升降温速度，环环相扣，缺一不可。临床上看似短短几分钟的冷冻操作，背后是整套标准化、严苛的实验室操作流程。
需要明确的是，-196℃液氮长期储存并不是风险最高的环节。胚胎最脆弱的阶段，是玻璃化之前的平衡、脱水、装载操作，以及后续复温、洗脱冷冻保护剂的全过程，这些步骤最考验实验室技术水平。
胚胎冷冻技术，始终围绕四大核心目标开展：
可逆地暂停胚胎代谢活动；
最大限度保留胚胎细胞结构与遗传物质完整性；
保证胚胎复苏之后，拥有正常的发育潜能；
实现操作流程稳定、可重复，适配临床应用。
我更愿意将这项技术称作生命的“暂停键”。它不是把生命冻成僵硬的冰块，而是以精密的低温生物学技术，让胚胎的发育暂时定格，静待未来重启、迎接新生。
作者：上海永远幸妇科医院医生 刘颖 博士
原标题：《怕细胞内部“长冰”，人类和一滴水较劲｜新民·健康新知》
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