Nat Chem Biol | 丁霄哲/陈欣泓等用靶向CA-IV的小分子递送模块，实现大分子药物跨越血脑屏障|丁霄哲|受体|大分子药物|小分子抑制剂|抗体|核酸|细胞|衣壳|陈欣泓

大脑作为哺乳动物生存最重要的器官之一，在演化过程中受到了格外严密的保护。脑毛细血管壁的内皮细胞彼此紧密相连，形成了特殊的血脑屏障（blood–brain barrier，BBB），从而把血液中的许多病原体和有害分子挡在神经组织之外。不过，这道屏障同时也让不少本可用于治疗的大分子，包括抗体、核酸、多肽和其他蛋白类药物隔离在脑外。因此，对于中枢神经系统药物开发而言，一个关键问题是如何把药送到脑内。

不过，血脑屏障虽然是一堵坚实的高墙，却也在墙上留了一些可以进出的门。为了获得维持正常功能所需的营养物质，大脑本身拥有一套精细的运输系统：一些分子先与脑血管内皮细胞表面的转运受体结合，被细胞摄取，再从血管的另一侧释放出来。过去十余年，研究者一直尝试让药物借道这种“受体介导的跨胞转运（receptor-mediated transcytosis）”进入脑内。

问题在于，过去已知的血脑屏障递送靶点数量屈指可数，而研究较多的转铁蛋白受体（TfR1）和CD98重链（CD98hc）等转运受体也有局限。例如，这些受体并非只存在于大脑，而是广泛分布于多种外周组织。药物一旦被赋予结合这些受体的能力，也可能增加在外周组织的分布、带来潜在风险。

近日，加州理工学院Viviana Gradinaru教授与Sarah Reisman教授团队在Nature Chemical Biology发表题为CA-IV-directed small-molecule shuttle enables targeted brain delivery of biologics的研究论文。研究者靶向一个相对富集于脑血管内皮细胞的全新递送靶点——碳酸酐酶IV（carbonic anhydrase IV，CA-IV）。他们开发了一种可以结合CA-IV的活化小分子；这个小分子“递送模块”（shuttle）可以通过一步化学反应连接到抗体等生物大分子“货物”（cargo）上，为药物带来与CA-IV受体结合的能力。团队将这套技术命名为BrainCAB。这种策略可以用于改造完整抗体、纳米抗体和siRNA。研究者发现，在偶联了BrainCAB后，抗体在小鼠和新生恒河猴研究中进入了脑实质，且没有额外增加抗体在周围组织的分布。同时，在给药后一周，BrainCAB递送的抗体仍保持升高的脑内水平。

图1｜BrainCAB技术概览。研究者从CA-IV结合分子出发，设计可一步连接到抗体等生物大分子“货物”(cargo)上的小分子“递送模块”(shuttle)；静脉给药后，偶联物与脑血管内皮细胞表面的CA-IV相互作用，并借助跨胞转运进入脑实质。

CA-IV，透脑递送的新“大门”

这项工作的最初起点，要从一类能够进入大脑的工程化腺相关病毒（AAV）载体说起。

经过定向进化的筛选后，一些从大规模随机文库中脱颖而出的工程化AAV载体获得了从血液中高效进入脑组织的能力。过去多年来，这些AAV载体已经在神经科学和基因治疗中获得了广泛的应用。可是，这些AAV载体只能用于递送核酸，而它们究竟在血脑屏障上找到了怎样的入口，这一具体的机制并没有直接的答案。

2023年，上文提到的加州理工学院Gradinaru教授团队曾在Science Advances报告了他们在这一机制问题上的一项成果。团队发现，在小鼠中，有几种高效透脑的工程化AAV载体依赖脑血管表面的CA-IV获得增强的脑转导能力。CA-IV原本是一种参与酸碱平衡的酶，此前并没有被认为具有转运受体的功能。BioArt此前曾对这项受体发现作过报道（相关阅读：）。值得注意的是，这两项研究一脉相承。此前共同主导CA-IV受体发现的Timothy F. Shay、Erin E. Sullivan和丁霄哲（共同第一作者），以及参与前作的陈欣泓，均继续参与了新的BrainCAB工作。

与许多已有的血脑屏障受体相比，CA-IV在脑血管内皮细胞中相对富集；尽管也存在于一些外周组织，但相较于转铁蛋白受体（TfR1）和CD98重链（CD98hc），其表达分布总体上更偏向脑血管。

接下来的问题便自然浮现出来：这种新的透脑机制是AAV独享的吗？能否使用CA-IV受体递送更广泛应用的药物种类，比如抗体？这便是这篇新论文所要回答的问题。

向进化学习：用小分子复刻AAV的“开门”机制

从机理上来说，设计BBB递送模块并不简单直接——递送模块分子不仅要结合转运受体，而且要能顺利进入后续的细胞内吞、通过正确的囊泡分拣、并成功在血脑屏障另一侧被释放。因此，结合受体的具体方式对透脑效率有着很大的影响。如果说受体是血脑屏障这堵墙上的一扇门，那么能否找到正确的门把手对于能否把门打开是个关键问题。

在过去，研究者们需要大量的试错来找到正确“门把手”的位置。而对于CA-IV，一处颇为巧妙的结构重合提供了一条捷径，让研究者们可以直接从进化筛选得到的答案中学习。

此前的结构建模提示，一种在小鼠中通过定向进化筛选出的高效透脑的工程化载体(AAV-9P31)，会把表面短肽中的芳香族氨基酸伸入小鼠CA-IV表面的一个深口袋，这说明这个口袋中的结合位点可能会是一个有效的“门把手”。而已发表的晶体结构显示，临床上用于治疗青光眼的药物布林佐胺（brinzolamide; BZA）也会进入同一个口袋，与AAV-9P31短肽在模型中占据的位置高度重叠。

图2｜从工程化AAV到小分子递送模块的结构相似性。左图为基于模型的AAV-9P31与小鼠CA-IV相互作用；中图来自布林佐胺(brinzolamide; BZA)与小鼠CA-IV的晶体结构；右图为可用于生物偶联的BZA-2C-NHS建模构象。三种结构或模型均指向CA-IV表面的同一深口袋；在右图的BZA-2C-NHS模型中，连接臂朝向口袋外侧。

这为研究者提供了一个现成的起点：无需从头设计全新的CA-IV结合分子，只需使用BZA作为递送模块(shuttle)的模板，并设法让BZA在结合受体的同时也能带上一件“货物”，就可能实现对AAV的分子逻辑的模拟。

团队将BZA露在受体口袋外的一端接入一小段连接臂，并在末端装上可与蛋白质表面已有的伯胺反应的活性基团。这样得到的小分子可以在温和条件下，通过单步反应连接到抗体或其他生物大分子的表面。

通过这种方式，研究者使用一个小分子复现了工程化AAV衣壳与CA-IV相遇时最关键的那段分子关系。团队将这套递送策略命名为BrainCAB，即 Brain access through Carbonic Anhydrase-binder Bioconjugation（通过碳酸酐酶结合分子的生物偶联实现脑递送）。

值得一提的是，由于BZA小分子递送模块较为紧凑的体型，它可以结合CA-IV催化口袋中更为保守的一片区域，从而与来自小鼠、恒河猴和人的CA-IV都进行相似的相互作用，这为跨物种的转化研究提供了便利。

研究者首先以抗PD-L1抗体阿替利珠单抗为模型。经过一步偶联，抗体获得了结合人、小鼠和恒河猴CA-IV的能力；与此同时，它原本识别PD-L1的亲和力基本保持不变。在体外细胞系中，偶联后的抗体还会被表达CA-IV的细胞摄取。

同时，研究者还验证了BrainCAB是一个高度模块化的方法。同一个小分子递送模块也可以偶联到其他完整抗体、纳米抗体和带有伯胺修饰的siRNA，并在体外赋予这些分子结合CA-IV或进入CA-IV阳性细胞的能力。因此，BrainCAB像是一个可以加装到不同分子上的可拆卸部件：原有药物负责识别治疗靶点，加装的小分子部件则负责打开CA-IV这扇通往大脑的门。

不仅能进大脑，也更少“走错门”

接下来，研究者比较了未经修饰的抗体和连接了BrainCAB的抗体在小鼠体内的去向。

偶联后的抗体并未只是短暂地出现在大脑中。其全脑浓度在给药后第5—7天达到峰值；第7天时，约为未经偶联抗体的8倍。也就是说，这种升高可以在单次给药后延续至少一周。

更值得注意的是，同一时间点的多数外周器官并没有出现相应幅度的增加。BrainCAB带来的变化并不是让抗体在全身各处都变多，而是让其分布更加偏向大脑。

当然，检测到全脑浓度升高还不等于证明抗体已经穿过血管壁——它也可能只是停留在脑血管中。为此，研究者将脑毛细血管与脑实质分离后分别检测；第7天时，偶联抗体在脑实质部分相对未偶联抗体也提高了约6.4倍。组织成像也显示，抗体信号并非局限于血管，而是广泛分布在血管之外的脑组织中。

同时，研究者也验证了这种透脑递送是由CA-IV本身而非其它机制介导的。在敲除了CA-IV的编码基因后，BrainCAB带来的脑内富集随之消失。另行进行的血管染料灌注实验显示，接受了BrainCAB的未见明显的整体性血脑屏障完整性的改变。

为了初步考察这种机制是否能使用于灵长类动物，团队随后在新生恒河猴中开展了探索性实验。单次静脉给药后第5天，连接BrainCAB的抗体在多个脑区中的水平均高于未偶联抗体；将脑血管与脑实质分开后，也能在脑实质部分观察到方向一致的升高。到第7天，偶联抗体在脑内仍然保持富集，尽管水平低于第5天。需要指出的是，由于这个实验中每个处理条件和时间点仅有一只动物，这些初步数据只能初步说明在灵长类动物里观察到了与小鼠一致的方向性信号，还不能可靠地估计效应大小。

BrainCAB仍处于早期研究阶段。这篇论文也还有很多没有回答的问题。例如，它尚未检验BrainCAB能否改善某种疾病中的治疗效果；其递送结果也有待在更大规模、年龄匹配的成年灵长类动物队列中验证。长期或多次给药是否安全，不同药物需要怎样的连接方式和CA-IV结合强度，以及递送效率是否会随年龄和疾病状态改变，也都需要后续研究逐一回答。母体药物BZA的既往临床使用经验，也不能直接外推为其衍生物或抗体偶联物的安全性。

从发现新递送机制，到开发新递送工具

值得一提的是，这项工作不仅获得了一种靶向CA-IV的小分子递送模块，同时也展示了一条开发药物递送工具的新路径。过去，工程化AAV主要作为完整的核酸递送载体接受筛选和优化。经过实验室定向筛选，这些病毒衣壳表面形成了许多影响组织嗜性和跨屏障能力的结构特征，其中也保留了如何识别受体、在受体表面何处结合，以及怎样的接触方式可能支持后续转运的分子线索。从这个角度看，工程化AAV还可以成为发现新受体和提炼新设计原则的起点。

这支加州理工团队前后相承的两项工作，恰好呈现了这条路径如何展开。前一项研究从脑嗜性AAV载体的递送表型出发，反向找到了CA-IV这一血脑屏障转运受体；新的研究继续深入到载体与受体的结合界面，发现AAV短肽与BZA指向CA-IV表面的同一个位点，并由此设计出可以偶联生物大分子的化学模块。一个由工程化病毒揭示的受体机制，就这样被转化为更小、更简单，也更容易模块化使用的递送工具。

把两项工作连在一起，可以看到一套相对完整的开发流程：先从进化筛选产生的递送表型中识别受体，再解析载体与受体的结合界面，提取其中经过验证的关键相互作用，随后用新的分子形式加以重建，并通过体内实验检验其递送能力。沿着这条路径，病毒衣壳中积累的结构信息得以转化为可合成、可偶联，并可能适配不同药物货物的化学递送模块。这种从进化结果中读取设计规则的思路，也为寻找其他跨越生物屏障的递送机制提供了一个值得继续探索的方向。

丁霄哲博士、陈欣泓博士、Philip Boehm博士和Alba Carretero-Cerdán博士为论文共同第一作者；丁霄哲博士、Sarah Reisman教授和Viviana Gradinaru教授为共同通讯作者。

https://www.nature.com/articles/s41589-026-02294-y

制版人：十一

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（*排名不分先后）