Nature | 人类转录因子“密码本”扩容：新增130个DNA结合基序|dna|位点|基序|密码本|特异性|细胞

撰文 |水王星

转录因子（Transcription Factor，TF）通过识别基因组上特定DNA序列，精准调控基因的表达过程，是细胞分化、发育、免疫和疾病发生的核心调控分子。2018年的统计数据显示，在人类已注释的约1600个推定转录因子中，超过四分之一缺乏已验证的DNA结合基序（motif，转录因子偏好结合的特征DNA短序列）。

大量未解析转录因子多属于C2H2锌指（C2H2-zinc finger，C2H2-zf）家族，和已知转录因子序列相似度极低，无法通过同源序列预测其结合偏好。同时学界长期存在争议，转录因子的固有序列特异性究竟能在多大程度上决定其在活细胞内的真实结合位点，目前仍不明确；染色质环境及辅因子等因素究竟会对其产生多大影响，同样缺乏定论。除此之外，基因组中非编码“暗物质”（转座子等重复序列）与转录因子的结合规律、基因变异如何干扰转录因子结合等关键问题，都缺少统一和完整的数据集支撑。

近日，由多伦多大学Timothy R. Hughes教授、洛桑联邦理工学院Bart Deplancke教授及俄罗斯科学院Ivan V. Kulakovskiy研究员领衔的国际合作团队（ Codebook联盟）在Nature发表了文章An expanded codebook of human transcription factor DNA-binding specificity，搭建覆盖332个特征不明人类转录因子的标准化实验体系，完成超4800组独立实验，一次性获得 177个全新转录因子DNA结合基序，扩充人类转录因子识别序列词汇库约130种，完整绘制人类转录因子结合密码图谱。

为全面刻画转录因子结合特性，研究团队整合五种互补实验技术，覆盖体外筛选与活细胞体内检测两类体系，这些方法包括高通量SELEX（HT-SELEX）、以基因组DNA为靶标的GHT-SELEX、蛋白结合微阵列（protein binding microarray, PBM）、SMiLE-seq，以及在HEK293细胞中开展的染色质免疫oprecipitation测序（chromatin immunoprecipitation sequencing, ChIP-seq）。为了确保结果的可靠性，研究团队设定了严格的判定标准，即同一转录因子的结合基序必须在两种及以上不同的实验体系中重现，并且能够跨数据集准确预测结合事件。最终，研究在177个推定转录因子中成功构建了高质量的位置权重矩阵（position weight matrix, PWM）。在这些获得基序的蛋白中，C2H2型锌指蛋白占比最高，该类蛋白的成功率达到了67%，证实了它们大多是具备DNA结合能力的转录因子。

为了验证体外实验获得的基序在生理条件下的真实性，研究团队进一步分析了130个成功转录因子的ChIP-seq数据。结果显示，预测的基序匹配序列在ChIP-seq富集峰中显著富集，表明转录因子的固有序列特异性在其基因组结合位点的选择中起主导作用。研究团队还定义了“三重优化重叠（triple optimized overlap, TOP）”位点，即同时在ChIP-seq、GHT-SELEX实验和PWM预测中均呈阳性的结合区域。对这些位点的进化保守性分析发现，85%的成功Codebook转录因子拥有至少一个保守的TOP位点，总计鉴定到113,577个此类功能性结合位点。这些位点大量分布于基因启动子区域，特别是CpG岛附近，且单个核苷酸的进化约束模式与PWM预测的亲和力贡献高度吻合，有力证明了新发现基序的功能性。

在上述基础上，研究团队进一步探索了这些新基序的进化起源与功能影响。研究发现了一类重要的进化现象，即16个解析完成的转录因子起源于古代DNA转座酶，它们保留了识别原始转座子重复序列的能力，证明转座子是转录因子及其顺式调控元件共同的进化来源。紧接着，研究人员系统分析了单核苷酸变异（single nucleotide variant,SNV）对转录因子结合的影响。分析共识别出超过1.2万个等位特异性结合事件（allele-specific binding,ASB），其中74%的变异结合偏好与基序预测结果完全吻合。这类干扰转录因子结合的突变，显著富集在疾病相关遗传位点与基因表达数量性状位点（expression quantitative trait locus,eQTL），为解读非编码区的致病突变提供了直接的分子工具。

之后，研究团队利用基序活性响应分析（motif activity response analysis, MARA）探究了这些转录因子对基因表达的调控作用。结果表明，Codebook转录因子对应的DNA结合基序，在不同组织样本里的功能活跃程度（通过该基序被占用及解释基因表达变化的程度来度量）与组织来源高度相关。例如，部分识别非甲基化CG序列的转录因子在免疫细胞及癌症样本中表现活跃，而另一些含有C2H2锌指结构域的转录因子则在神经系统发育相关的样本中选择性表达。这说明新发现的转录因子参与了从免疫应答到神经分化等多种关键的生物学过程。

该工作首次完成大规模、多平台的人类未知转录因子系统测绘，填补数百个蛋白的结合特异性空白，大幅完善人类转录因子密码数据库。研究建立的多实验联合验证、保守位点筛选、变异结合预测整套分析流程，为后续基因调控、非编码疾病突变、转座子进化相关研究提供标准化范式，新发现的调控因子也为神经退行性疾病、自身免疫病、肿瘤提供全新候选治疗靶点。