2026年9月9日，中国药科大学、中国药科大学天然药物研究团队庞涛、胡立宏、胡杨教授等在Acta Pharmacologica Sinica（中科院2区，IF=10.4）在线发表题为 “3-Hydroxydehydroleucodin ameliorates neuroinflammation and ischemic brain injury by blocking the TRIM21-PRDX1 interaction” 的研究论文。该研究围绕苦碟子注射液活性成分3-羟基去氢木香内酯（3-hydroxydehydroleucodin, 3-Hyd）改善缺血性脑损伤的作用机制展开，发现3-Hyd能够直接结合过氧化物还原酶1（peroxiredoxin 1, PRDX1）的V51和R128关键位点，阻断E3泛素连接酶TRIM21与PRDX1之间的相互作用，抑制TRIM21介导的PRDX1泛素化降解，从而维持PRDX1蛋白稳定性。进一步研究表明，稳定表达的PRDX1可调控TRAF6泛素化水平，抑制NF-κB炎症信号通路激活，降低小胶质细胞介导的神经炎症反应，并改善缺血性脑损伤。该研究首次揭示了“3-Hyd–TRIM21/PRDX1–TRAF6–NF-κB”神经炎症调控轴，为天然产物靶向调控蛋白稳定性干预缺血性脑损伤提供了新的机制依据。
缺血性脑卒中是全球范围内导致高致残率和高死亡率的重要疾病之一。虽然血管再通治疗能够恢复缺血区域血流，但再灌注过程往往伴随继发性脑损伤，即脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI）。其中，由小胶质细胞异常激活驱动的神经炎症，被认为是影响疾病进展和神经功能恢复的重要因素。
苦碟子注射液（Kudiezi injection, KDZ）是一种来源于菊科植物抱茎苦荬菜（Ixeris sonchifolia）的传统中药制剂，在缺血性脑卒中的辅助治疗中已有较广泛应用。已有研究显示，KDZ能够减轻脑梗死面积、改善神经功能缺损，并降低IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子表达。然而，由于KDZ属于多成分复杂体系，其发挥脑保护作用的关键活性物质及具体分子机制仍未完全明确。
本研究首先通过体外炎症模型筛选KDZ主要活性成分，发现倍半萜内酯类化合物 3-羟基去氢木香内酯（3-hydroxydehydroleucodin, 3-Hyd） 表现出较强的抗炎活性。随后，研究人员结合转录组分析、化学生物学靶点筛选、蛋白互作验证以及小鼠缺血性脑卒中模型，系统解析了3-Hyd发挥神经保护作用的分子机制。
研究发现，3-Hyd能够直接结合过氧化物还原酶1（peroxiredoxin 1, PRDX1）的V51和R128位点，破坏PRDX1与E3泛素连接酶TRIM21之间的异常相互作用，从而抑制TRIM21介导的PRDX1 K109位点K48连接型多聚泛素化，减少PRDX1经蛋白酶体降解。稳定积累的PRDX1进一步抑制TRAF6泛素化，并阻断下游NF-κB炎症信号通路。
值得注意的是，在小胶质细胞特异性Prdx1条件性敲低（Cx3cr1Cre/ERT2）小鼠中，3-Hyd的抗神经炎症和脑保护作用明显减弱，进一步证明PRDX1是其发挥作用的重要功能靶点。
该研究提出了一个新的 TRIM21–PRDX1–TRAF6调控轴，揭示了通过药理学方式稳定PRDX1蛋白、阻断TRIM21–PRDX1相互作用可能成为调控缺血性脑损伤相关神经炎症的新策略。
▼文章亮点
1. 从复杂中药体系中筛选确定关键活性成分3-Hyd
研究系统比较KDZ主要成分的抗炎能力，明确3-Hyd是KDZ发挥抗神经炎症作用的重要候选活性物质，为解析传统中药复方作用机制提供了新的分子基础。
2. 揭示3-Hyd直接靶向PRDX1的新机制
研究利用化学生物学策略发现3-Hyd直接结合PRDX1，并确定V51和R128为关键结合位点，实现了从“小分子活性发现”到“直接蛋白靶点鉴定”的机制突破。
3. 首次建立TRIM21–PRDX1–TRAF6神经炎症调控通路
研究进一步发现，PRDX1并非简单参与氧化应激调控，而是通过调节TRAF6泛素化状态影响NF-κB炎症信号，为理解小胶质细胞稳态调控提供了新的理论框架。
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【摘 要】
缺血性脑卒中（ischemic stroke）是全球范围内导致死亡和长期残疾的重要疾病之一。缺血后神经炎症反应，尤其是小胶质细胞异常激活，是导致缺血性脑损伤进一步发展的关键因素。然而，目前针对神经炎症调控的有效治疗策略仍然有限。
苦碟子注射液（Kudiezi injection, KDZ）是一种用于缺血性脑卒中辅助治疗的传统中药制剂，但其发挥神经保护作用的关键活性成分及分子机制尚未完全明确。本研究旨在鉴定KDZ中的关键活性成分，并阐明其调控神经炎症和改善缺血性脑损伤的作用机制。
本研究首先通过LPS诱导的小胶质细胞炎症模型筛选KDZ中的活性成分，发现3-羟基去氢木香内酯（3-hydroxydehydroleucodin, 3-Hyd）具有显著抗炎活性。进一步研究发现，3-Hyd能够抑制小胶质细胞促炎表型激活，降低TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子表达，并在短暂性大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）小鼠模型中减少脑梗死面积、改善神经功能缺损。
机制研究结合RNA测序、化学生物学靶点筛选、蛋白互作分析、表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）、细胞热转移实验（cellular thermal shift assay, CETSA）以及分子对接分析等方法，发现3-Hyd能够直接结合过氧化物还原酶1（peroxiredoxin 1, PRDX1）的V51和R128位点。进一步研究表明，3-Hyd通过阻断E3泛素连接酶TRIM21与PRDX1之间的相互作用，抑制TRIM21介导的PRDX1泛素化降解，从而维持PRDX1蛋白稳定性。
稳定表达的PRDX1进一步抑制TRAF6泛素化，并降低NF-κB炎症信号通路激活水平，从而减少小胶质细胞炎症反应。此外，在小胶质细胞特异性Prdx1条件敲低小鼠模型（Cx3cr1Cre/ERT2）中，3-Hyd的神经保护作用明显减弱，进一步证明PRDX1是其发挥作用的重要功能靶点。
综上，本研究揭示了3-Hyd通过调控“TRIM21/PRDX1/TRAF6/NF-κB”信号轴改善缺血性脑损伤的新机制，发现天然产物可通过稳定关键蛋白、调节蛋白互作网络发挥抗神经炎症作用，为缺血性脑卒中的治疗提供了潜在干预靶点和新的药理学策略。
01
研究背景及科学问题
缺血性脑卒中（ischemic stroke）是全球范围内导致死亡和长期残疾的重要疾病之一，其主要病理特征是脑血流供应中断，引起神经元缺氧、能量代谢障碍以及继发性组织损伤。尽管目前血管再通治疗能够有效恢复缺血区域血流，但由于治疗时间窗有限，以及再灌注过程中产生的氧化应激、炎症反应和细胞损伤，许多患者仍会出现严重的神经功能障碍。因此，深入解析缺血性脑损伤发生发展的关键机制，并寻找新的神经保护策略具有重要意义。
缺血性脑损伤后的神经炎症反应是促进继发性脑损伤的重要因素。其中，小胶质细胞（microglia）作为中枢神经系统中的主要免疫细胞，在维持脑内稳态、清除损伤组织以及调节炎症反应过程中发挥关键作用。然而，在缺血刺激后，小胶质细胞会发生异常激活，并释放大量促炎介质，包括肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）等，从而进一步放大神经炎症反应，加重脑组织损伤。因此，调控小胶质细胞炎症状态、恢复其稳态功能，被认为是改善缺血性脑损伤的重要研究方向。
苦碟子注射液（Kudiezi injection, KDZ）是一种来源于菊科植物抱茎苦荬菜（Ixeris sonchifolia）的传统中药制剂，在缺血性脑卒中的辅助治疗中已有较广泛应用。已有研究显示，KDZ能够减少脑缺血再灌注模型中的脑梗死面积，改善神经功能缺损，并降低IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎因子的表达。然而，由于KDZ包含多种化学成分，其发挥神经保护作用的关键活性物质以及对应的分子机制仍尚未完全明确。
3-羟基去氢木香内酯（3-hydroxydehydroleucodin, 3-Hyd）是一种存在于苦碟子中的倍半萜内酯类化合物。研究人员发现，3-Hyd可能是KDZ发挥抗炎作用的重要活性成分，但其是否能够直接调控缺血性脑损伤过程中的炎症反应，以及其具体作用靶点和分子机制仍缺乏系统研究。因此，明确3-Hyd的药理作用机制，不仅有助于阐明传统中药发挥疗效的物质基础，也可能为缺血性脑卒中的药物开发提供新的候选分子。
过氧化物还原酶1（peroxiredoxin 1, PRDX1）是一种具有抗氧化和炎症调控功能的重要蛋白，在维持细胞氧化还原稳态以及调节免疫反应过程中发挥作用。然而，在缺血性脑损伤过程中，PRDX1是否受到蛋白稳定性调控，以及其如何参与小胶质细胞炎症反应调节，目前仍缺乏深入认识。
基于上述科学问题，本研究通过多组学分析、化学生物学筛选以及动物模型验证，系统探索3-Hyd调控缺血性脑损伤的分子机制。研究发现，3-Hyd能够直接结合PRDX1蛋白V51和R128位点，阻断E3泛素连接酶TRIM21与PRDX1之间的相互作用，抑制TRIM21介导的PRDX1泛素化降解，从而维持PRDX1蛋白稳定性。进一步研究表明，PRDX1通过调控TRAF6泛素化水平，抑制NF-κB炎症信号通路激活，最终降低小胶质细胞炎症反应并改善缺血性脑损伤。该研究提出了“3-Hyd–TRIM21/PRDX1–TRAF6–NF-κB”新的神经炎症调控轴，为缺血性脑卒中的机制研究和药物干预提供了新的理论依据。
02
重要发现及亮点
3-Hyd是苦碟子注射液发挥抗神经炎症作用的关键活性成分
缺血性脑卒中后，小胶质细胞过度激活导致的神经炎症反应是促进脑组织继发性损伤的重要因素。苦碟子注射液（Kudiezi injection, KDZ）作为一种传统中药制剂，已被用于缺血性脑卒中的辅助治疗，但其发挥神经保护作用的关键活性成分和具体作用机制仍不明确。
研究人员首先对KDZ中的主要化学成分进行抗炎活性筛选，包括木犀草苷（luteoloside）、芹菜素（apigenin）、绿原酸（chlorogenic acid）、咖啡酸（caffeic acid）、熊果酸（ursolic acid）以及3-羟基去氢木香内酯（3-hydroxydehydroleucodin, 3-Hyd）等。
通过LPS刺激BV2小胶质细胞建立炎症模型后，研究人员检测不同化合物对炎症因子释放的影响。
结果发现，在相同处理条件下，3-Hyd表现出较强的抗炎活性，可显著降低LPS诱导的TNF-α释放，因此被确定为KDZ发挥抗炎作用的重要候选活性成分。
进一步实验显示，3-Hyd能够显著抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症反应。在原代小胶质细胞和骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs）中，3-Hyd均能够降低TNF-α释放，并减少Il-1β、Il-6和Tnf-α等促炎基因表达，同时促进抗炎因子Il-10表达。
此外，在氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）模拟缺血再灌注损伤模型中，3-Hyd同样能够降低炎症相关基因表达，提示其可能参与调控缺血环境中的神经炎症过程。
图1：3-Hyd是KDZ发挥抗炎作用的关键活性成分，并改善缺血性脑损伤。
（A）苦碟子注射液（KDZ）主要化学成分的结构示意图。
（B）不同KDZ活性成分对LPS诱导BV2细胞TNF-α释放的影响。BV2细胞经不同化合物（5 μM）预处理后，加入LPS刺激，采用ELISA检测培养上清中TNF-α水平。
（C）3-Hyd对LPS诱导BV2细胞炎症反应的影响。不同浓度3-Hyd处理后，通过ELISA检测TNF-α释放水平。
（D）3-Hyd对原代小胶质细胞炎症因子表达的影响。细胞经LPS刺激后，采用RT-qPCR检测Il-1β、Il-6、Tnf-α和Il-10基因表达水平。
（E）3-Hyd对BMDMs炎症反应的影响。通过ELISA检测TNF-α水平，并采用RT-qPCR检测炎症相关基因表达。
（F）OGD/R模型中3-Hyd对炎症反应的调控作用。采用RT-qPCR检测缺氧复氧条件下炎症相关基因表达变化。
（G）tMCAO小鼠模型建立及3-Hyd给药流程示意图。
（H）TTC染色检测不同处理组小鼠脑梗死面积。3-Hyd处理降低缺血半球梗死比例。
（I）神经功能评分分析。采用Longa评分评价缺血后神经功能缺损情况。
（J）改良神经功能缺损评分（mNSS）和转棒实验评价3-Hyd对长期神经功能恢复的影响。
数据表示为平均值 ± 标准误（mean ± SEM）。
统计学分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。
*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
3-Hyd通过抑制NF-κB信号和异常自噬调节神经炎症
为了进一步探索3-Hyd发挥抗炎作用的潜在机制，研究人员利用LPS刺激BMDMs，并开展RNA测序（RNA-seq）分析。
结果显示，3-Hyd处理后产生大量差异表达基因，其中包括炎症反应、自噬过程以及蛋白泛素化相关基因。
GO和KEGG富集分析显示，3-Hyd调控的差异基因主要集中于：
NF-κB炎症信号通路；
蛋白泛素化调控过程；
巨自噬（macroautophagy）相关过程。
进一步Western blot实验验证发现，3-Hyd能够明显降低LPS诱导的p65磷酸化水平，抑制NF-κB通路激活，同时降低pro-IL-1β表达。
此外，3-Hyd能够调节异常自噬过程。研究发现，炎症刺激导致LC3B-II积累增加，而3-Hyd处理能够降低LC3B-II水平并恢复SQSTM1/p62表达。
利用mRFP-GFP-LC3B双荧光自噬检测系统进一步发现，3-Hyd主要减少自噬体形成，而不是阻断自噬溶酶体降解过程。
这些结果提示，3-Hyd能够通过同时调节NF-κB炎症信号和自噬过程，抑制小胶质细胞异常激活。
图2：RNA测序揭示3-Hyd调控炎症、自噬及泛素化相关通路。
（A）BMDMs实验处理流程示意图。
（B）RNA测序分析获得的差异表达基因火山图。
（C）差异表达基因热图分析。
（D）GO富集分析显示3-Hyd调控基因主要参与炎症反应、自噬过程以及蛋白修饰过程。
（E）KEGG通路富集分析显示NF-κB信号通路、自噬相关通路以及泛素化相关过程显著富集。
（F）Western blot检测LPS刺激条件下3-Hyd对NF-κB信号通路的影响。
（G）检测p65磷酸化水平及pro-IL-1β表达变化。
（H）Western blot检测自噬相关蛋白LC3B-II和SQSTM1/p62表达。
（I）mRFP-GFP-LC3B双荧光检测自噬通量变化。
比例尺（scale bar）= 20 μm。
数据表示为平均值 ± SEM。
统计学分析采用单因素方差分析。
*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
3-Hyd直接结合PRDX1并确定关键结合位点
为了进一步明确3-Hyd发挥抗炎作用的直接分子靶点，研究人员采用化学生物学策略对3-Hyd结合蛋白进行筛选。
首先，研究人员构建生物素标记的3-Hyd探针（3-Hyd-Biotin），利用链霉亲和素磁珠进行pull-down实验，并结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析寻找潜在结合蛋白。
质谱分析结果显示，过氧化物还原酶1（peroxiredoxin 1, PRDX1）在3-Hyd探针富集蛋白中显著富集。随后，通过竞争性pull-down实验进一步验证发现，未标记的3-Hyd能够竞争性降低PRDX1与3-Hyd-Biotin探针之间的结合，证明PRDX1是3-Hyd的直接结合靶蛋白。
进一步利用细胞热转移实验（cellular thermal shift assay, CETSA）发现，3-Hyd能够提高PRDX1蛋白的热稳定性；表面等离子共振实验（surface plasmon resonance, SPR）进一步证实3-Hyd与PRDX1之间存在直接结合关系。
随后，研究人员通过分子对接模拟预测3-Hyd与PRDX1可能存在多个结合区域，并利用PRDX1突变实验进行验证。
结果显示，PRDX1蛋白中的V51和R128两个氨基酸残基是3-Hyd发挥结合功能的重要位点。当V51和R128发生突变后，3-Hyd与PRDX1之间的结合能力明显降低，说明这两个位点对于3-Hyd识别PRDX1具有关键作用。
这些结果证明，PRDX1是3-Hyd发挥药理作用的直接靶点，并揭示了天然产物通过结合特定蛋白位点调控炎症过程的新机制。
图3：3-Hyd直接结合PRDX1并鉴定关键结合位点。
（A）3-Hyd-Biotin探针结构示意图及靶蛋白筛选流程。
（B）利用3-Hyd-Biotin进行蛋白pull-down实验，并通过银染分析结合蛋白。
（C）LC-MS/MS质谱分析鉴定与3-Hyd结合的候选蛋白，其中PRDX1被筛选为潜在直接靶点。
（D）Western blot验证pull-down产物中的PRDX1富集情况。
（E）竞争性pull-down实验验证3-Hyd与PRDX1之间的特异性结合关系。加入未标记3-Hyd后，PRDX1与3-Hyd-Biotin之间的结合受到竞争抑制。
（F）CETSA实验检测3-Hyd对PRDX1蛋白稳定性的影响。结果显示，3-Hyd处理提高了PRDX1热稳定性。
（G）SPR实验检测3-Hyd与PRDX1之间的直接结合能力。
（H）分子对接模拟预测3-Hyd与PRDX1结合模式。
（I）PRDX1关键氨基酸位点突变分析。构建PRDX1 V51A、R128A以及V51A/R128A突变体，检测其与3-Hyd结合能力变化。
数据表示为平均值 ± SEM。
统计学分析采用单因素方差分析。
*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
PRDX1是3-Hyd发挥神经保护作用的关键功能靶点
在确定PRDX1为3-Hyd直接结合蛋白后，研究人员进一步验证PRDX1是否参与3-Hyd介导的神经保护作用。
研究人员利用Cx3cr1Cre/ERT2转基因小鼠构建小胶质细胞特异性Prdx1敲低模型，并进一步建立tMCAO缺血性脑损伤模型。
实验结果显示，在正常PRDX1表达条件下，3-Hyd能够显著降低脑梗死面积，改善神经功能缺损。
然而，在小胶质细胞特异性Prdx1敲低小鼠中，3-Hyd降低脑梗死面积以及改善神经行为学表现的作用明显减弱。
进一步分析发现，PRDX1缺失导致小胶质细胞炎症状态增强，促炎因子表达升高，同时削弱3-Hyd对NF-κB炎症信号的抑制作用。
这些结果表明，PRDX1并不是3-Hyd作用过程中的伴随变化蛋白，而是其发挥抗炎和神经保护作用所必需的关键功能靶点。
图4：小胶质细胞PRDX1缺失削弱3-Hyd对缺血性脑损伤的保护作用。
（A）Cx3cr1Cre/ERT2小鼠中小胶质细胞特异性Prdx1敲低模型建立流程示意图。
（B）检测不同处理组小鼠脑组织中PRDX1表达水平，验证Prdx1敲低效率。
（C）tMCAO模型中不同处理组脑梗死面积分析。采用TTC染色评价缺血损伤程度。
（D）神经功能评分分析。通过Longa评分评价急性期神经功能缺损。
（E）长期神经功能恢复评价。采用mNSS评分以及转棒实验检测运动功能恢复情况。
（F）免疫荧光染色分析缺血区域小胶质细胞活化状态。
（G）检测炎症相关因子表达变化，分析PRDX1缺失对3-Hyd抗炎作用的影响。
数据表示为平均值 ± SEM。
统计学分析采用双因素方差分析（two-way ANOVA）。
*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
3-Hyd通过抑制TRIM21介导的PRDX1泛素化降解维持PRDX1稳定性
在明确PRDX1是3-Hyd关键功能靶点后，研究人员进一步探索3-Hyd调控PRDX1蛋白稳定性的具体机制。
研究发现，3-Hyd并不会显著影响PRDX1基因转录水平，而主要通过调节PRDX1蛋白降解过程发挥作用。
进一步实验显示，炎症刺激条件下，PRDX1蛋白水平明显下降，而蛋白酶体抑制剂MG132能够恢复PRDX1表达，提示PRDX1主要通过泛素-蛋白酶体系统进行降解。
随后，研究人员分析参与PRDX1降解过程的E3泛素连接酶。
通过蛋白互作筛选发现，TRIM21能够与PRDX1发生相互作用，并促进PRDX1泛素化修饰。
Co-IP实验进一步证明，在炎症刺激条件下，TRIM21与PRDX1结合增强，并促进PRDX1发生K48连接型多聚泛素化，导致PRDX1降解。
而3-Hyd处理能够显著降低PRDX1泛素化水平，并阻断TRIM21与PRDX1之间的相互作用。
这些结果表明，3-Hyd通过干扰TRIM21-PRDX1蛋白互作，抑制PRDX1泛素化降解，从而维持PRDX1稳定表达。
图5：3-Hyd通过阻断TRIM21介导的PRDX1泛素化降解提高PRDX1稳定性。
（A）不同处理条件下PRDX1蛋白和mRNA水平检测，分析3-Hyd对PRDX1表达调控方式。
（B）利用蛋白酶体抑制剂MG132验证PRDX1蛋白降解途径。
（C）Co-IP实验检测TRIM21与PRDX1之间的蛋白互作关系。
（D）泛素化实验检测TRIM21对PRDX1泛素化水平的影响。
（E）检测3-Hyd处理后PRDX1泛素化水平变化。
（F）分析3-Hyd对TRIM21-PRDX1相互作用的影响。
（G）检测PRDX1不同泛素链类型变化，确定TRIM21介导PRDX1降解的泛素化形式。
（H）PRDX1关键位点突变实验分析TRIM21介导泛素化修饰区域。
结果显示，TRIM21促进PRDX1发生K48连接型多聚泛素化修饰，而3-Hyd能够抑制该过程。
数据表示为平均值 ± SEM。
统计学分析采用单因素方差分析。
*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
TRIM21介导PRDX1 K109位点K48连接型泛素化降解
在发现TRIM21参与PRDX1蛋白稳定性调控后，研究人员进一步解析TRIM21介导PRDX1降解的具体分子机制。
首先，研究人员通过蛋白互作实验确认TRIM21能够直接结合PRDX1。进一步泛素化实验发现，TRIM21能够显著促进PRDX1泛素化修饰，而敲低TRIM21则明显降低PRDX1泛素化水平，提示TRIM21是调控PRDX1稳定性的关键E3泛素连接酶。
随后，研究人员进一步分析PRDX1发生泛素化修饰的具体位点。通过质谱分析发现，PRDX1蛋白中的K109位点可能是TRIM21介导泛素化修饰的重要区域。
为了验证这一推测，研究人员构建了PRDX1 K109R突变体，并检测其泛素化水平。
结果显示，与野生型PRDX1相比，K109R突变显著降低了TRIM21诱导的PRDX1泛素化水平，同时增强了PRDX1蛋白稳定性。
此外，研究人员进一步分析不同类型泛素链对PRDX1降解的影响，发现TRIM21主要促进PRDX1发生K48连接型多聚泛素化修饰，而不是K63连接型泛素化。
K48连接型泛素链通常作为蛋白酶体降解信号，因此该结果说明，TRIM21通过促进PRDX1 K109位点K48连接型泛素化，诱导PRDX1进入蛋白酶体降解途径。
而3-Hyd能够阻断这一过程，从而维持PRDX1蛋白水平。
图6：TRIM21通过促进PRDX1 K109位点K48连接型泛素化介导PRDX1降解。
（A）Co-IP实验检测TRIM21与PRDX1之间的相互作用关系。
（B）TRIM21过表达或敲低后，检测PRDX1泛素化水平变化。
（C）利用质谱分析鉴定PRDX1潜在泛素化修饰位点。
（D）构建PRDX1不同赖氨酸位点突变体，检测TRIM21介导的PRDX1泛素化变化。
（E）检测PRDX1 K109R突变对蛋白稳定性的影响。
（F）泛素链类型分析，检测TRIM21诱导PRDX1发生K48连接型或K63连接型泛素化修饰。
（G）检测3-Hyd对TRIM21介导PRDX1泛素化降解过程的影响。
结果显示，TRIM21主要通过促进PRDX1 K109位点K48连接型多聚泛素化，诱导PRDX1蛋白酶体依赖性降解，而3-Hyd能够抑制该过程。
数据表示为平均值 ± SEM。
统计学分析采用单因素方差分析。
*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
PRDX1通过调控TRAF6泛素化抑制NF-κB炎症信号激活
在明确3-Hyd通过TRIM21-PRDX1轴维持PRDX1稳定性后，研究人员进一步探索PRDX1如何调控下游炎症信号。
TRAF6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6）是连接炎症受体信号和NF-κB通路的重要调控分子，其泛素化状态决定了下游炎症信号的激活程度。
研究人员发现，PRDX1能够与TRAF6发生相互作用，并调控TRAF6泛素化水平。
在炎症刺激条件下，PRDX1表达降低导致TRAF6泛素化增强，促进NF-κB信号通路激活。
而3-Hyd处理后，由于PRDX1蛋白稳定性提高，TRAF6异常泛素化受到抑制，NF-κB信号活化水平下降。
进一步实验显示，PRDX1敲低能够削弱3-Hyd对TRAF6泛素化以及NF-κB信号的抑制作用。
这些结果说明，PRDX1是连接3-Hyd干预与炎症信号调控之间的重要桥梁。
图7：PRDX1通过调节TRAF6泛素化抑制NF-κB炎症信号通路。
（A）Co-IP实验检测PRDX1与TRAF6之间的蛋白互作关系。
（B）检测PRDX1表达变化对TRAF6泛素化水平的影响。
（C）检测3-Hyd处理后TRAF6泛素化修饰变化。
（D）Western blot检测PRDX1调控NF-κB信号通路相关蛋白变化。
（E）检测p65磷酸化水平以及下游炎症因子表达变化。
（F）PRDX1敲低实验验证PRDX1在3-Hyd抑制NF-κB激活过程中的必要作用。
结果显示，PRDX1通过降低TRAF6异常泛素化水平抑制NF-κB信号激活，从而减少炎症因子表达。
数据表示为平均值 ± SEM。
统计学分析采用单因素方差分析。
*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
3-Hyd通过TRIM21/PRDX1/TRAF6/NF-κB轴改善缺血性脑损伤
基于前述实验结果，研究人员进一步整合3-Hyd调控神经炎症的完整分子机制。
研究发现，在缺血性脑损伤过程中，炎症刺激诱导TRIM21活化，促进PRDX1发生K109位点K48连接型泛素化修饰，导致PRDX1蛋白降解。
PRDX1水平降低后，TRAF6泛素化增强，进一步激活NF-κB信号通路，促进小胶质细胞释放大量促炎因子，加重神经炎症和脑损伤。
而3-Hyd通过直接结合PRDX1 V51和R128位点，阻断TRIM21与PRDX1之间的相互作用，减少PRDX1降解。
稳定表达的PRDX1进一步抑制TRAF6异常泛素化，降低NF-κB炎症信号激活，最终减少小胶质细胞炎症反应并改善缺血性脑损伤。
该机制揭示了天然产物通过调控蛋白-蛋白相互作用和蛋白稳定性发挥神经保护作用的新模式。
图8：3-Hyd通过阻断TRIM21-PRDX1互作改善缺血性脑损伤的作用机制模式图。
缺血性脑损伤条件下：
缺血刺激 → TRIM21激活 → PRDX1 K109位点K48连接型泛素化增强 → PRDX1蛋白降解 → TRAF6泛素化增加 → NF-κB信号激活 → 小胶质细胞炎症反应增强 → 神经损伤加重。
3-Hyd干预后：
3-Hyd结合PRDX1 V51/R128位点 → 阻断TRIM21-PRDX1相互作用 → 抑制PRDX1泛素化降解 → 稳定PRDX1表达 → 抑制TRAF6/NF-κB炎症信号 → 减轻神经炎症 → 改善缺血性脑损伤。
【贡献】★★★★★
本研究围绕苦碟子注射液活性成分3-Hyd改善缺血性脑损伤的作用机制展开，通过细胞模型、动物模型、多组学分析以及化学生物学技术，系统揭示了3-Hyd调控神经炎症的新机制。
研究发现，3-Hyd能够直接结合PRDX1蛋白V51和R128关键位点，阻断E3泛素连接酶TRIM21与PRDX1之间的异常相互作用，抑制TRIM21介导的PRDX1 K109位点K48连接型泛素化降解。
稳定表达的PRDX1进一步调控TRAF6泛素化水平，抑制NF-κB炎症信号通路激活，从而降低小胶质细胞异常炎症反应并改善缺血性脑损伤。
总体而言，该研究提出了“3-Hyd–TRIM21/PRDX1–TRAF6–NF-κB”神经炎症调控轴，揭示了天然产物通过稳定关键调控蛋白、调节蛋白互作网络发挥药理作用的新机制，为缺血性脑卒中及相关神经炎症疾病的治疗研究提供了新的潜在靶点。
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